風池(GB20) 釣藤散 약침이 국소 뇌손상으로 유발된 흰쥐의 인지장애에 미치는 영향

The Effects of Jodeungsan Pharmacopuncture at GB20 on Cognitive Impairment Induced by Focal Brain Injury in Rats

Article information

Acupunct. 2016;33(4):49-63
Publication date (electronic) : 2016 December 20
doi : https://doi.org/10.13045/acupunct.2016054
1Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, Dongseo Korean Medical Hospital
2Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Dongshin University
3Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, Chung-Yeon Korean Medical Hospital
4Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, Bu-Cheon Jaseng Hospital of Korean Medicine
5Department of Merdian & Acupoint, College of Korean Medicine, Dongshin University
현민경1, 모민주1, 황두리1, 양태준2, 이정훈2, 이은지3, 윤태경4, 윤대환5,
1동서한방병원 침구의학과
2동신대학교 한의과대학 침구의학교실
3청연한방병원 침구의학과
4부천자생한방병원 침구의학과
5동신대학교 한의과대학 경혈학교실
*Corresponding author: Department of Merdian & Acupoint, College of Korean Medicine, Dongshin University, 185, Gunjae-ro, Naju, 58245, Republic of Korea. Tel: +82-61-330-3527, E-mail: human22@dsu.ac.kr
Received 2016 November 9; Revised 2016 November 25; Accepted 2016 December 2.

Trans Abstract

Objectives

This research was performed to investigate the effects of Jodeungsan pharmacopuncture( PA-J) of focal brain ischemia induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO) in rats.

Methods

The subjects were divided into 4 groups : control, acupuncture , pharmacopuncture PA-J1(11.43 ㎎ / 250 g / 40 ㎕) and pharmacopuncture PA-J2(2.29 ㎎ / 250 g / 40 ㎕). The focal brain ischemia was induced by intraluminal filament insertion into the middle cerebral artery. After 3 days of MCAO, Jodeungsan pharmacopuncture treatment was performed on the GB20, and the day after being treated with pharmacopuncture, the Morris water maze test was carried out on the assigned group. The series of processes were administered 6 times. Thereafter mGluR5, density of neuronal cell and ChAT were measured.

Results

The results were as follows.

1. The distance to target significantly decreased in the 2nd trial of the Acu group on the water maze test for short-term memory.

2. The distance to target significantly decreased in the 4th trial of the PA-J2 group on the water maze test for long-term memory.

3. The intensity of mGluR5 significantly increased in the PA-J1 group compared with the control group.

4. The neuroprotective effect on the hippocampal CA1 significantly increased in the PA-J1 and PA-J2 groups compared with the control group.

5. The density of ChAT in the hippocampal CA1 significantly increased in the PA-J1 and PA-J2 groups compared with the control group.

Conclusions

These results suggest that Jodeungsan pharmacopuncture may improve memory and cognitive impairment and also have neuroprotective effects on focal brain ischemia.

Ⅰ. 서론

치매란 뇌조직의 변성 또는 노화, 혈관성 장애, 뇌손상, 중추신경계 감염, 독성 대사장애, 기타 신경계 질환 등의 원인으로 인해[1] 뇌기능이 손상되면서 기억력, 언어 능력, 시공간 파악 능력, 판단력 및 추상적 사고력 등의 인지기능이 전반적이고 지속적으로 저하되는 증상이다[2].

치매는 원인 질환에 따라 알츠하이머형 치매, 혈관성 치매, 전측두엽성 치매 등으로 분류할 수 있는데[3] 그중 알츠하이머형 치매와 혈관성 치매 모두에서 인지장애가 유발되는 병리적 기전에 비정상적인 뇌혈류 저하를 포함한 혈관인자가 작용하며[4] 특히 우리나라와 일본에서는 서구보다 혈관성 치매가 더 흔하다고 알려져 있어[5] 혈관성 치매가 보다 중요하게 인식되고 있다.

혈관성 치매는 허혈성 및 출혈성 뇌혈관질환 또는 심혈관 질환에 의한 허혈성-저산소성 뇌병변과 관련된 치매의 임상적인 한 형태로[6] 뇌혈류 공급 부족에 의하여 뇌조직이 산소와 포도당 공급을 제한받게 되면 세포막이 붕괴되고 에너지 생산 과정의 와해로 인해 세포대사의 변화를 초래하면서 뇌조직이 손상을 받아 운동장애, 감각장애, 인지장애 등의 복합적인 장애를 일으키게 된다[7].

風池(GB20)는 足少陽膽經의 經穴로 手足少陽經과 陽維脈의 交會穴이며, 목뒤 후두골 아래의 양쪽에 위치하는데 祛風開竅, 解表淸熱하여 頭痛, 耳鳴, 上下肢不遂, 視神經萎縮 등의 증상에 사용된다[8].

釣藤散은 許叔微의 저서인 《普濟本事方》[9]에 처음 수록된 방제로서 平肝潛陽하는 효능이 있으며 補氣健脾, 理氣化痰하는 약물이 배합되어 있어 氣虛挾痰을 바탕으로 한 肝風內動에 효과가 있는 처방이다[10]. 최근 釣藤散의 인지장애 개선 효과의 기전을 밝히는 연구들이 활발하게 이루어져 학습과 기억에 관련한 아세틸콜린을 증가시키는 효능과 신경보호능이 있는 것으로 보고되고 있다[11-15]. 그러나 이는 대부분 국외에서 시행된 연구들로 현재까지 국내 연구 발표는 부족한 실정이다.

이에 저자는 風池(GB20) 釣藤散 약침이 허혈성 국소 뇌손상으로 유발된 흰쥐의 인지장애에 미치는 영향을 알아보고자 Morris water maze test와 면역조직화학법을 이용하여 공간 기억과 신경 보호 작용에 미치는 효과를 관찰한 후 다음과 같은 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험재료

1) 동물

체중이 약 210 g∼230 g인 Sprague Dawley계의 수컷 흰쥐들을 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24 ± 1 ℃, 습도 60 ± 5 %) 내에서 고형사료(pellet, Samyang, Korea)와 물을 충분히 공급하며 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험 기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취시켰다.

본 실험은 동신대학교 동물실험윤리위원회(No.2015-09-02)의 승인을 받아 시행하였다.

2) 약침액 조제

동신대학교 부속 순천한방병원에서 구입한 釣藤散의 구성약물(Table 1)을 1첩(28 g)당 1,000 ㎖의 1차 증류수와 함께 100 ℃에서 열수 추출하고 원심분리기(Vision 6000CFI, Korea)로 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액은 rotary evaporator (Buchi, Netherlands)로 수분을 증발시켜 100 ㎖로 감압 농축하였으며, 농축된 약침액을 동결건조기(Samwon, Korea)로 -70 ℃에서 동결건조시켜 최종적으로 얻어진 약침액의 양은 16 g이었다. 이를 소분하여 생리식염수로 희석하였으며, pH meter(ORION, USA)로 각각 pH 7 산도를 조절하여 조제한 후 냉장보관하였다가 시술에 사용하였다.

Composition of Jodeungsan

2. 실험방법

1) Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO)에 의한 허혈성 국소 뇌손상 유발

국소 뇌허혈은 Longa 등[16]의 방법에 따라 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 유발하였다. 80 % O2에 5 % isoflurane (Hana Pharm, Korea)을 이용하여 흰쥐에게 흡입마취를 유도한 후 2 % isoflurane으로 마취를 계속 유지하였다. 좌측 중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선을 따라 피부를 절개하고 흉골설골근과 저작근 사이에 좌측 총경동맥을 노출시켜 좌측 내경동맥의 원위부를 최대한 확보한 후 미세혈관 클립(WPI, USA)을 이용하여 결찰하고, 좌측 내경동맥과 intraluminal filament(직경 0.28 mm rounded tip) 사이의 출혈을 방지하고자 6-0 silk suture를 이용하여 좌측 총경동맥 근위부 및 좌측 외경동맥 분지부를 결찰하였다. 좌측 총경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측 내경동맥 분지부에서 1 ㎝정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(WPI, USA)를 사용하여 혈관을 절제하고, 미세혈관 클립 또한 제거한 후 좌측 내경동맥 내로 20 ㎜의 치과 인상제(Durelon, Germany)가 발린 intraluminal filament를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때까지 약 17 ㎜ 깊이로 부드럽게 삽입한 후, 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하여 좌측 중대뇌동맥 부위에 국소 허혈을 유발하였다. 출혈을 방지하기 위하여 좌측 내경동맥상의 intraluminal filament 삽입 부위를 가볍게 묶은 후 절개된 피부를 봉합하였다.

2) 군 분리 및 시술

군 분리는 Ischemia 유발 후 무처치한 대조군(Con, n = 5)과 Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침은 시행하지 않고 혈위 단자만 시행한 침자군(Acu, n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침 11.43 ㎎ / 250 g / 40 ㎕을 시술한 PA-J1군(n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침 2.29 ㎎ / 250 g / 40 ㎕을 시술한 PA-J2군(n = 5)의 총 4군으로 분리하였다.

3) 취혈 및 시술

風池(GB20)는 occipital bone의 아랫면에서 흉쇄유돌근과 승모근 사이의 오목한 곳으로 인체 상응하는 부위로 정하였으며[8], 자침 및 약침 시술은 2일에 1회씩 총 6회에 걸쳐 이루어졌고(Fig. 1), 약침 시술의 경우 insulin syringe (31 G × 8 ㎜, BD, USA)를 이용하여 風池(GB20) 양측에 각각 20 ㎕의 약침을 주입하였다.

Fig. 1

Schematic design of experimental procedures for acupuncture and pharmacopuncture treatment(A) and Morris water maze test(B)

4) Morris water maze test

Morris water maze test를 위하여 원형수조(117 × 50 cm)에 물을 채우고, 물의 온도는 24 ± 1 ℃의 적정 온도를 유지하고, 실험 공간의 밝기는 전체가 어두운 환경에서 4분면을 정하여 간접 조명하고, 수조 안에 platform(20 × 32 cm)을 설치하였다.

Morris water maze test는 총 6차례 이루어졌으며, 각 차수마다 훈련을 4회 실시하였다. 수조를 4등분하여 1차부터 6차까지 platform을 같은 4분면에 두었으며, 수조 테두리에 방위를 표시하여 매 회마다 30초 간격을 두고 수영 시작 지점을 다르게 하였다. 한 차수에서 4회 반복 수영하는 과정 중 1분 안에 찾지 못하면 위치를 기억할 수 있도록 platform 위에 올려 15초 동안 주위를 관찰하도록 하여 인지를 시키고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다. 1분 안에 platform을 찾아 올라가면 그 순간부터 15초 동안 platform에서 주위를 관찰하도록 두었고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다.

Water maze test는 자침 및 약침 처치 다음 날 실시하였으며 총 6차에 걸쳐 시행하였고(Fig. 1), test는 흰쥐를 원형수조에 넣고 platform을 찾아가기까지 걸린 거리를 측정하였다. 본 실험에서는 1차에서 1회 훈련을 제외하고 2회 훈련부터 4회 훈련을 단기 기억으로 보았고 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기 기억으로 보았다.

5) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

(1) Total RNA 분리

적출된 뇌는 신속히 액체 질소에 급속 냉동시키고 분석할 때까지 -70 ℃에서 보관하였다. Total RNA의 분리는 뇌 조직(300 ㎎)을 800 ㎕ Tripure Isolation Reagent (Roche, Germany)로 균질화하고 균질액에 200 ㎕의 chloroform(Sigma, USA)을 가하여 15초 동안 흔들어 잘 혼합한 후 실온 상태에서 5분간 방치하고, 세포 유잔물을 제거하기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상층액과 500 ㎕ 의 isopropanol(sigma, USA)을 첨가하여 실온 상태에서 5분 동안 방치한 후 RNA pellet을 얻기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리로 생긴 pellet에 냉장보관된 70 % ethanol과 함께 DEPC를 넣어 4 ℃, 7,500 rpm에서 5분간 원심분리 후 pellet만 남기고 모두 제거하고, 남은 ethanol은 실온에서 5분간 방치해 건조시킨 다음 DEPC-treated water에 녹여 spectrophotometer(Eppendorf, Germany)에서 OD260 값을 읽어 RNA의 순도 및 농도를 정량하였다.

(2) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

분리된 total RNA 5 ㎍과 2.5 ㎕ Oligo (dT), DEPC-treated water를 RT premix(Bioneer, Korea)에 넣어 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)를 이용하여 50 ㎕ cDNA를 합성하고 PCR 증폭을 위한 template로 사용하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) (sense primer : 5'-ACTCCATCACCATCTTCCAG-3', antisense primer : 5'-CCTGCTTTCACCACCTCCTTG-3')를 internal control로 사용하였다. Reverse transcription temperature cycle은 42 ℃에서 1시간 동안 cDNA synthesis, 94 ℃에서 5분 동안 denature 그리고 4 ℃에서 5분 동안 cooling시키는 단계를 거쳤다. Polymerase chain reaction은 cDNA, 10pg sense primer, 10pg antisense primer, DEPC-treated water를 PCR premix(Bioneer, Korea)에 넣었다. PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95 ℃에서 300초 동안 pre-denaturation, 94 ℃에서 40초 동안 melting, 55 ℃에서 40초 동안 annealing, 72 ℃에서 90초 동안 extension하는 과정을 34회 반복 수행한 후 마지막 cycle에서 72 ℃에서 600초 동안 extension 단계를 거치고 primer (senseprimer : 5'-TCCAATCTGCTCCTCC TACC-3', antisense primer : 5'-CAACGATGAAGAACTCT GCG-3')를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 mGluR5 유전자증폭을 시행하였다. 이렇게 증폭된 mGluR5의 DNA를 Greenview nucleic acid gel stain(IO Rodeo, 1 : 10,000)을 포함한 1.5 % agarose gel상에서 0.5x TBE buffer(80 mM Tris-HCL, 80 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3)로 100 V에서 전기 영동시켜 관찰한 후 Image Station(Kodak, Japan)을 이용하여 촬영하였으며, Alphaease FC StandAlone Software(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.

6) Immunohistochemistry

(1) Cresyl violet 염색

모든 실험이 끝난 직후 흰쥐를 Urethane(25 %, Sigma, USA)으로 마취시킨 후, 0.9 % saline 200 ㎖에 이어 phosphate buffer로 준비한 5 % formalin 용액(fixative) 800 ㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200 ㎖는 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800 ㎖는 천천히 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 10 % formalin 용액으로 고정시키고, 30 % sucrose가 함유된 phosphate buffered saline(PBS)에 넣어 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 다음 날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직의 hippocampus 부위를 30 ㎛의 두께로 잘랐다. PBS로 조직을 몇 차례 씻고 xylene(5 min), 100 % alcohol(2 min), 95 % alcohol(1 min), 70 % alcohol(1 min), D.W.(2 min)순으로 옮겨 담아 탈지, 탈수를 시킨 다음 cresyl violet buffer(5 min)로 염색을 하였다. 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program (Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.

(2) Choline acetyltransferase(ChAT)

뇌 조직은 초기에 0.1 M PBS에 3회 정도 세척하였고, 2 % 토끼 혈청으로 30분 blocking한 후, 각각 ChAT anti-body(1 : 500, monoclonal, Millipore, USA)를 사용하였다. 1차 항체는 0.1 M PBS에 0.1 % sodium azide (Sigma, St. Louis, MO, USA) buffer로 500배 희석하여 준비하였다. 뇌 조직은 1차 항혈청에 4 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 3회 이상 조직을 0.1 M PBS로 세척한 다음 biotinylated universal Secondary Antibody(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 37 ℃ 에서 30분 동안 반응시켰다. 0.1 M PBS로 3회 세척한 다음, 뇌 조직은 37 ℃에서 30분 동안 Streptavidin peroxidase preformed complex(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 담갔다. 0.1 M PBS로 3회 세척한 다음 조직을 착색제로서 diaminobenzidine(DAB)을 사용하여 발현시키고, 0.1 M PB로 발색을 정지시켰다. 슬라이드를 dehydtration한 후에 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.

3. 통계처리

모든 측정값은 Excel statistic program(Microsoft, USA)을 이용하여 평균치와 표준오차(mean ± standard error)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(SPSS 12.0, USA)를 사용하여 비모수적 방법으로 Mann-Whitney U test를 시행하였다. 각 실험군은 대조군에 비하여 α = 0.05 수준(p < 0.05)과 α = 0.001 수준(p < 0.001)에서 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. 결과

1. 단기 기억에 미치는 영향

風池(GB20) 釣藤散 약침이 단기 기억에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군의 1회 차에서 32.4 ± 4.12 cm, 2회 차에서 21.4 ± 5.42 cm, 3회 차에서 14.6 ± 6.11 cm, 4회 차에서 14.6 ± 6.74 cm를 나타내었다.

대조군에 비해 Acu군의 2회 차에서 4.6 ± 1.16 cm로 유의한 감소를 보였다(p < 0.05)(Table 2, Fig. 2).

Changes of Distance(short-term memory) to Target on Water Maze Test in Occlusion-induced Ischemia in Rats after Jodeungsan Pharmacopuncture(cm)

Fig. 2

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of distance(short-term memory) to target on water maze test in occlusion-induced ischemia in rats

A description of controls and experimental groups refer to Table 2.

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

2. 장기 기억에 미치는 영향

風池(GB20) 釣藤散 약침이 장기 기억에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군의 2차에서 16.8 ± 4.37 cm, 3차에서 16.5 ± 3.55 cm, 4차에서 8.3 ± 1.38 cm, 5차에서 14.6 ± 3.55 cm, 6차에서 14.8 ± 4.57 cm를 나타내었다.

대조군에 비해 PA-J2군의 4차에서 4.7 ± 1.01 cm로 유의한 감소를 보였다(p < 0.05)(Table 3, Fig. 3).

Changes of Distance(long-term memory) to Target on Water Maze Test in Occlusion-induced Ischemia in Rats after Jodeungsan Pharmacopuncture(cm)

Fig. 3

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of distance(long-term memory) to target on water maze test in occlusion-induced ischemia in rats

A description of controls and experimental groups refer to Table 3.

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

3. mGluR5 발현에 미치는 영향

風池(GB20) 釣藤散 약침이 hippocampal CA1 부위의 mGluR5 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 103.1 ± 10.31(× 1000 O.D.), Acu군은 124.8 ± 4.37 (× 1000 O.D.), PA-J1군은 132.5 ± 4.14 (× 1000 O.D.), PA-J2군은 117.4 ± 6.61(× 1000 O.D.)을 각각 나타내었다.

대조군에 비해 PA-J1군에서 유의한 증가를 나타내었다(p < 0.05)(Fig. 4).

Fig. 4

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of intensity of mGluR5 mRNA in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

4. 신경세포 손상 방어 효과에 미치는 영향

風池(GB20) 釣藤散 약침이 hippocampal CA1 부위의 cresyl violet으로 염색된 신경세포의 밀도에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 20.4 ± 0.61(density), Acu군은 21.3 ± 0.51(density), PA-J1군은 25.3 ± 1.44(density), PA-J2군은 24.8 ± 0.87(density)을 각각 나타내었다.

대조군에 비해 PA-J1군과 PA-J2군이 유의하게 증가하였다(p < 0.001)(Fig. 5, 6).

Fig. 5

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the density of cresyl violet-stained neural cell sections in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.001 statistically significant compared with control group.

Fig. 6

Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1

A; Con group, B; Acu group, C; PA-J1 group, D; PA-J2 group. Cresyl violet-stain. × 40. scale bar; 500 μn.

5. ChAT 발현에 미치는 영향

風池(GB20) 釣藤散 약침이 hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 37.3 ± 0.78(density), Acu군은 37.7 ± 0.92(density), PA-J1군은 53.9 ± 0.84(density), PA-J2군은 57.4 ± 0.81(density)을 각각 나타내었다.

대조군에 비해 PA-J1군과 PA-J2군이 유의하게 증가하였다(p < 0.001)(Fig. 7, 8).

Fig. 7

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the density of Choline acetyltransferase (ChAT)-stained sections in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.001 statistically significant compared with control group.

Fig. 8

Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1

A; Con group, B; Acu group, C; PA-J1 group, D; PA-J2 group. ChAT-stain. × 40. scale bar; 500 μn.

Ⅳ. 고찰

치매란 대뇌반구 특히 대뇌피질 및 해마를 침범하는 미만성 질환에 의해 나타나는 지능, 행동 및 성격 등의 점진적 황폐화를 의미하는 것으로[17] 치매의 핵심증상은 인지장애와 정신병 상태, 공격성, 우울, 불안, 격정, 수면장애 등의 행동증상이 겹쳐 나타나는 것이다[1].

치매의 원인 질환 중에서 가장 큰 비율을 차지하는 것은 알츠하이머형 치매와 혈관성 치매이며, 그 밖의 루이체 치매, 전측두엽 퇴행, 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환들과 두부 외상, 뇌종양, 대사성 질환, 결핍성 질환, 중독성 질환 그리고 감염성 질환 등의 다양한 원인 질환에 의해서도 치매가 발생할 수 있다[18].

치매가 유발되는 기전에 대해서 고전적으로는 베타아밀로이드 단백질 침착이 가장 주된 원인으로 지목되었으나 임상 및 실험연구를 통해 점차 혈관인자들의 주된 역할이 밝혀지고 있으며[19,20] 대부분의 치매에서 알츠하이머병의 주된 양상인 amyloid plaque 및 neurofibrillary tangle과 허혈성 손상이 공존하고 있다는 것이 병리학적으로 밝혀지면서 인지기능에서 뇌혈관의 중요성이 강조되고 있다[21].

이에 최근에는 경미한 인지기능 저하에서부터 명확한 치매의 상태까지 모든 단계와 관련하여 뇌혈관인자에 의해 유발되는 인지장애를 혈관성 인지장애로 정의하고 있는데[22] 뇌허혈에 의한 신경세포의 손상기전은 초기와 후기로 나뉘고 대부분은 초기에 일시적인 혈관폐쇄로 인해 혈류의 제한을 받아 조직의 산소와 포도당 고갈에 의한 에너지 대사 이상이 유발되며, 신경연접부위로 방출된 glutamate의 재흡수가 방해를 받아 세포 사이 공간에 glutamate 과다 축적이 일어나고 세포막 투과성에 변화가 일어나 Ca2+ 등 양이온의 세포 내 대량 유입이 일어난다. 세포는 결국 산소와 혈당 공급의 소실로 산성혈증과 세포부종 및 단백질 변성 등이 일어나 신경세포가 괴사하여 사망하게 된다[23]. 후기에는 재관류 후 세포막의 붕괴와 에너지 생산 과정의 와해로 세포대사의 변화가 일어나 허혈 상태보다 더욱 심한 조직손상을 가중시키는 세포자멸사, 즉 지연성 세포사가 일어나는데[24] 허혈 후 주어진 자극에 대한 예민성 증가에 의한 신경세포의 과활동, 칼슘을 매개로 하는 글루탐산 흥분독성, 미토콘드리아 손상과 단백질 합성의 장애, 유리산소기에 의한 손상, 에너지 대사와 뇌혈액 순환이상 등이 관여할 것으로 여겨지고 있다[25]. 결국 뇌혈관 병변으로 인한 신경세포의 손상은 기억력, 인지기능, 행동조절에 관여하는 대뇌의 주요 부분이 제 기능을 하지 못하게 되어 기억력 감퇴, 마비, 발음장애 등의 증상을 유발하며 보행장애, 운동장애, 자세 불안정, 반복적인 넘어짐, 빈뇨 혹은 요실금, 성격과 감정의 변화, 실행능력의 이상 등의 초기 임상증상을 발생시키게 된다[26].

한의학에서는 《景岳全書》에서 ‘癡呆’라 하여 최초로 치매에 관하여 언급하였으며, 그 이후 《石室秘錄》, 《辨症奇聞》 등에서 이를 ‘呆病’이라 칭하고 그 증상 및 치료법을 비교적 자세하게 기록하였는데 그 이전에는 ‘癲狂症’, ‘健忘症’, ‘鬱症’, ‘痰濕’, ‘虛勞’ 등 치매와 유사한 서로 다른 병증에 포함하여 치매를 파악한 것으로 생각된다[27].

釣藤散은 許叔微의 《普濟本事方》[9]에 처음 수록된 방제로 主治는 “治肝厥頭暈, 淸利頭目”이라 하였고, 平肝熄風의 釣鉤藤, 菊花, 理氣化痰의 半夏, 乾薑, 陳皮, 補氣健脾의 茯苓, 人蔘을 배합하여 熄風, 健脾化痰하여 氣虛挾痰의 肝風內動을 치료하며, 淸熱하는 石膏와 滋陰하는 麥門冬을 배합하여 熱症과 陰虛가 동반하는 경우에도 적용이 가능하다. 또한 熄風의 효능을 祛風하는 防風이 보조하고 있다[10].

최근 釣鉤藤을 대상으로 학습과 기억에 관련된 아세틸콜린의 변화에 대한 실험연구와 인지기능의 변화에 대한 임상연구를 수행하여 효과가 있다는 보고들이 발표되고 있다[11-15]. Mizushima 등[11]의 연구에서는 노화촉진 마우스 모델에서 기억 보존 능력 향상으로 인한 수동적 회피 반응의 개선이 관찰되었고, Yokoyama 등[12]은 釣藤散이 산화 과정에 의한 손상을 감소시켜 지연성 신경세포사에 대하여 신경 보호 효과가 있음을 밝혔다. 또한 뇌허혈을 유발한 생쥐 모델에서 Obi 등[13]은 釣藤散이 신경 보호 작용이 있는 것으로 보고된 Macrophage colony stimulating factor의 mRNA 발현을 증가시키는 결과를 얻었고, Murakami 등[14]은 釣藤散 투여 후 아세틸콜린이 증가하는 것을 보이며 muscarinic M1 receptor 자극을 통한 공간인지장애 개선 효과가 있는 것을 보고하였다. 釣藤散에서 釣鉤藤이 차지하는 효과를 검증하려는 실험이 시도되면서 Watanabe 등[15]은 釣藤散이 가지고 있는 항치매 효과는 부분적으로 釣鉤藤이 가진 인돌계 성분과 페놀성 성분들의 작용에 의한 것이라는 결과를 발표했다. 이와 같이 선행된 연구들의 실험항목이 본 연구와 상이하여 각 항목의 비교 평가에는 어려움이 있으나 상기 연구들의 결과를 바탕으로 釣藤散 약침이 기억장애 및 인지장애 개선에 유효할 것으로 사료되어 본 연구를 진행하였다.

뇌허혈 유발을 위한 실험 모델에는 양측 경동맥 또는 척추동맥결찰과 저혈압을 이용한 전뇌허혈과 중대뇌동맥결찰법을 이용한 국소뇌허혈의 두 가지 방법이 주로 사용되고 있다[28]. 전자의 경우 측부순환이 없고 정상체온에서 4~8분 내에 비가역적인 신경세포 파괴가 발생하지만[29], 후자의 경우 전뇌에만 제한적인 허혈 상태를 유발하기 때문에 후뇌의 혈류가 영향을 받지 않아 호흡과 체순환에 영향을 주지 않는 장점이 있어[28] 본 연구에서는 이를 이용하였다.

최근 MCAO에 의한 허혈성 국소 뇌손상 유발 모델을 대상으로 약침의 효과를 관찰한 연구가 이루어지고 있는데, 한 등[30]은 當歸 약침을 血海(SP10)에 자입한 결과 방사형 미로 학습의 오행로 선택수는 감소하고 정행로 선택률은 증가하였으며, 뇌혈류량 및 혈압, Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어 효과, ChAT 발현, Nerve growth factor(NGF) 발현이 모두 증가하였고, 약침의 농도가 치료효과의 중요한 변수가 되었다고 보고하였다. 석 등[31]은 水蛭의 주성분인 Hirudin 약침을 合谷(LI4)에 자입한 후 뇌경색 부위의 용적을 측정하고 피라미드 신경세포의 변화를 광학현미경으로 관찰한 결과 뇌허혈로 인한 신경세포 손상에 효과가 있음을 보고하였고, 윤 등[32]은 足三里(ST36)에 시술된 竹瀝 약침에 대한 연구에서 방사형 미로 학습의 오행로 선택수는 감소하고 정행로 선택률은 증가하여 공간 학습능력 및 기억측정의 유효한 회복이 관찰되었으며, Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어 효과, AchE 발현, ChAT 발현이 증가하는 결과로 choline성 뉴런의 보호 작용에 일정한 효과를 보고하였다. 또한 김 등[33]은 川芎 약침을 肩井에 자입한 결과 방사형 미로 학습에서 오행로 선택수는 감소하고 정행로 선택률은 증가하여 공간 학습능력 및 단기 기억에서 유효한 회복이 있었고, Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어 효과, AchE 발현, ChAT 발현, NGF 발현이 증가하여 choline성 뉴런의 보호 작용 및 신경재생인자에 효과가 있으며, 특히 0.008 g/kg의 농도에서 뇌허혈로 인한 뇌세포 손상에 보호 작용이 있는 것으로 보고하였다. 鹿茸 약침을 이용한 연구가 2건 있었는데, 김 등[34]은 心正格인 大敦(LR1), 少衝(HT8), 少海(HT3), 陰谷(KI10)에 자입하여 방사형 미로 학습의 오선택 수가 감소하고 대조군에 비해 높은 정선택률을 보였으며, Cresyl violet을 이용한 신경세포의 손상 방어 효과 및 AchE 발현이 증가하는 결과를 발표하였고, 이 등[35]은 腎兪(BL23), 至室(BL52)에 시술할 경우 guanylate cyclase와 관련하여 뇌혈관의 직경을 확장시킴으로써 국소 뇌혈류량을 증가시키고, 뇌허혈 후 재관류 과정에서 불안정하게 증가되었던 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 개선시키는 항허혈 작용을 보고하였다. 가장 최근의 연구로는 百會(GV20) 石菖蒲 약침이 Bax level 감소, Bcl-2 level 증가, Bax/Bcl-2 ratio 감소, 세포사멸을 촉진하는 인자인 Cytochrome c level 감소, ChAT 발현 증가를 보여 뇌허혈로 유발된 치매 병태에 유의한 효과가 있음을 발표한 장 등[36]의 보고가 있었다.

본 연구의 取穴은 足少陽膽經의 經穴로 祛風開竅, 解表淸熱하여 頭痛, 耳鳴, 上下肢不遂, 視神經萎縮 등의 증상에 상용되는 風池(GB20)를 택하였고[8], 유사하게 風池(GB20) 약침에 대한 연구도 2건 있었는데, 나 등[37]은 天麻 약침을 이용해 mGluR5 발현 증가, Bax 발현 감소, Bcl-2 발현 증가, Bax/Bcl-2 ratio 감소, Cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상 방어 효과와 ChAT 발현 증가를 보여 뇌신경세포에 대한 신경 보호 및 anti-apoptosis 작용을 통한 허혈성 뇌신경세포손상을 억제시키는데 효과적이라고 보고하였고, 이 등[38]은 抑肝散 약침으로 Morris water maze test에서 목표 도달 시간이 감소하였으며 Bax 발현과 Bax/Bcl-2 ratio 감소, Cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상 방어 효과와 ChAT 발현이 증가하는 결과를 보였고, 이를 통해 허혈성 뇌손상으로 인한 인지장애 및 기억장애를 개선시키고 뇌신경 세포 손상을 억제하며 세포자멸사를 억제시키는데 효과적이라고 발표하였다.

자침 및 약침 시술은 MCAO를 시행한 3일 후에 시작하였는데, 흰쥐에 뇌허혈을 유발하고 재관류하였을 때 해마의 CA1 부위의 신경세포들이 재관류 72시간 후에 죽기 시작한다는 것과[39] 시술 직후에 흰쥐가 받는 스트레스를 고려하였다.

이와 같은 기존 연구를 토대로 風池(GB20) 釣藤散 약침이 국소 뇌손상 유발 흰쥐 모델의 인지장애에 미치는 영향을 알아보고자 Morris water maze test를 시행하고 hippocampus CA1 부위의 mGluR5, Density of cresyl violet-stained neural cell, ChAT 발현 정도를 관찰하였다.

Morris water maze test는 동물의 공간학습능력과 기억능력을 측정하기 위해 사용되는 장치로 공간정보 외의 단서들을 통제하기 쉬운 장점이 있어 물로 채워진 원통형 수조 내에서 근접단서나 냄새를 추적단서로 사용할 수 없도록 하고 주어진 단서들의 배열만으로 자신의 위치를 학습하여 숨겨진 platform 찾는 검사이다. 이 과제를 통하여 동물이 주변에 있는 단서들을 사용하여 인식하고 기억하는 공간기억능력을 검사할 수 있다[40,41].

본 실험에서는 자침 및 風池(GB20) 釣藤散 약침을 시술한 다음 날 훈련을 시행하여 총 6차례에 걸친 훈련에서 각 차수별로 총 4회의 훈련이 이루어졌으며, 정 등[42]의 연구를 참고하여 1차 훈련 시 1회를 제외한 2회에서 4회까지의 훈련을 단기 기억으로 보았고, 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기 기억으로 구별하여 평가하였다.

단기 기억에서는 PA-J1군의 4회 차를 제외한 모든 군에서 platform에 도달하기까지 거리가 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으며, 그중에서도 유의한 감소를 보인 것은 Acu군의 2회 차로(p < 0.05) 단기 기억에 대해서는 釣藤散 약침보다 침을 시술한 군의 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.

장기 기억에서는 대조군에 비해 Acu군과 PA-J1군, PA-J2군의 모든 차수에서 platform에 도달하기까지 거리가 감소하는 경향을 보여 風池(GB20) 자침 및 釣藤散 약침 시술이 장기 기억 회복에도 효과를 보였고, 특히 PA-J2군의 4차에서 유의한 감소가(p < 0.05) 일어나 장기 기억에 있어서는 風池(GB20) 釣藤散 약침의 효과가 가장 우수했다. 다만 4차 훈련까지는 모든 군에서 platform에 도달하는 거리가 꾸준하게 감소하는 모습을 보이다가 이후의 훈련에서는 오히려 증가하는 양상을 나타내는데, 이러한 결과는 Diamond 등[43]의 연구 결과에 근거하여 장기간 동안 스트레스를 유발하는 환경에 노출된 것을 원인으로 해마가 손상되어 오히려 공간 기억 능력이 저하된 것이 아닌가 생각된다.

뇌허혈에 의한 세포손상의 기전에서 흥분성 신경전달물질은 허혈세포로부터 방출된 후 신경세포를 흥분시키고 나트륨과 칼슘을 세포 내로 유입하여 비가역적인 세포 손상을 유발한다[26]. 특히 Glutamate는 허혈성 뇌손상에서 매우 중요한 역할을 담당하는 흥분성 신경전달물질인데 강력한 신경독 작용으로 세포막 인지질의 파괴를 촉진하고 신경세포의 손상을 초래한다[44]. mGluR5(metabotropic Glutamate Receptors)는 해마 CA1구역 추체신경세포에 발현되는 주요한 수용체로서, 산소 결핍이나 산화질소 독성에 대한 신경보호[44] 및 신경조직형성[45]의 작용이 있으며 뇌허혈 상황에서는 기능이 감소되는 것[46]으로 알려져 있다.

본 연구에서 Acu군과 PA-J1군, PA-J2군 모두에서 대조군에 비해 mGluR5의 밀도가 증가하는 경향을 보이며, 그중에서도 PA-J1군에서 유의한 증가가(p < 0.05) 관찰되어 風池(GB20) 釣藤散 약침이 mGluR5의 발현을 통한 신경보호 및 신경조직형성 효과를 유도한 것으로 보인다.

해마는 대뇌의 관자엽 안쪽에 위치하며 학습과 기억에 필수적인 역할을 하는 곳으로 뇌가 발생하고 분화하는 시기 이후에도 신경세포가 분열하며, 기억장애와 관계되는 구심성 및 원심성 신경섬유가 많이 연결되어 있기 때문에[47] 해마를 구성하는 신경세포의 증가는 학습과 기억의 저장을 향상시킬 수 있고, 반대로 해마 신경세포의 퇴화나 손상은 기억 및 인지기능에 저하를 가져오게 된다[48]. 그중에서도 CA1 구역의 추체신경세포는 뇌허혈에 가장 민감하게 반응하는 신경세포로 CA1 추체신경세포가 나타내는 세포수의 변화, 각종 유전자 및 단백질 발현의 변화 등은 뇌허혈에 대한 신경세포 손상 기전과 약물의 신경손상에 대한 보호 효과를 연구하는데 가장 많이 사용되는 지표이다[49].

각 군의 해마 CA1 부위를 Cresyl violet에 염색한 후 관찰한 결과, 대조군에 비해 모든 군에서 신경세포의 밀도가 증가하는 것을 볼 수 있었으며 특히 PA-J1군, PA-J2군에서 유의하게 증가하여(p < 0.001) 風池(GB20) 釣藤散 약침이 뇌허혈로 유발된 신경세포 손상에 대한 방어 효과가 있는 것으로 생각된다.

해마의 콜린성 섬유들은 신경전달물질인 Acetylcholine(Ach), Ach의 합성효소인 choline acetyltransferase(ChAT), Ach의 가수분해효소인 acetylcholine esterase (AchE)를 합성한다. Ach은 신경세포의 synaptic knobs의 세포질에서 생합성되어 synaptic vesicles 안에 저장된 후 교감 및 부교감 신경계의 presynaptic fiber, 부교감성 postsynaptic fiber에서 분비되며 화학적 신호인 impulse를 교감 및 부교감 신경의 preganglionic neuron에서 postganglionic neuron으로 전달하고 AchE에 의해 신속하게 분해가 된다[50,51]. 뇌허혈 상태에서는 Ach의 방출 감소, ChAT-면역반응성 소실 등으로 해마 CA1구역 추체신경세포의 지연성 신경세포사가 유도된다[52]. 이를 근거로 해마에서 ChAT의 활성을 증가시키면 아세틸콜린의 합성을 촉진시켜 기억력 및 인지장애를 개선하는 효과가 있을 것으로 사료된다.

각 군의 해마 CA1 부위 ChAT 발현 정도를 관찰한 결과 모든 군에서 대조군보다 증가하였고, PA-J1군과 PA-J2군에서 유의한 증가를 보여(p < 0.001) 風池(GB20) 釣藤散 약침이 ChAT 활성을 증가시키고 콜린성 신경섬유의 기능 회복을 돕는 작용이 있을 것으로 판단된다.

본 연구에서는 Morris water maze를 이용한 행동학적 변화에 있어 단기 기억 및 장기 기억의 유의한 회복이 관찰되었으며, mGluR5 발현, 신경세포 밀도, ChAT 발현에 유효한 영향이 있는 것으로 나타나 風池(GB20) 釣藤散 약침이 뇌허혈 상태에서 신경세포 손상을 방어하는 신경 보호 효과와 아세틸콜린을 증가시키는 효능으로 인지장애를 개선하는데 유효할 것이라고 사료된다. 다만 단기 기억에 있어서는 Acu군에서 보다 우수한 효과를 보였는데 이는 혈관성 치매 환자의 단기 기억장애에 침치료를 활용할 수 있는 근거가 될 것으로 생각된다. 또한 장기 기억에서는 PA-J2군, mGluR5 발현에서는 PA-J1군, 신경세포의 밀도와 ChAT 발현에서는 PA-J1군과 PA-J2군 모두에서 유의미한 결과가 나타나 각 항목에 대한 유의성과 風池(GB20) 釣藤散 약침의 농도가 비례하는지 여부를 밝히기에는 어려움이 있었다. 앞으로 국내에서도 활발한 연구가 이루어져 본 연구의 한계를 보완하고 임상에서 釣藤散을 활용할 수 있는 실험적 근거가 마련되길 기대한다.

Ⅴ. 결론

風池(GB20) 釣藤散 약침이 중대뇌동맥 폐쇄로 유발된 국소 뇌손상 흰쥐 모델에 미치는 영향을 실험적으로 알아보고자 Morris water maze test를 이용한 행동학적 변화와 신경세포 손상에 대한 신경화학적 변화를 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

  • 1. Morris water maze test에서 釣藤散 약침이 단기 기억에 미치는 영향은 Acu군의 2회 차에서 유의한 감소를 보였고, 장기 기억에 미치는 영향은 PA-J2군의 4차에서 유의한 감소를 보였다.

  • 2. mGluR5 발현 정도는 대조군에 비해 PA-J1군에서 유의하게 증가하였다.

  • 3. Cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상 방어 효과는 대조군에 비해 PA-J1군과 PA-J2군에서 유의하게 증가하였다.

  • 4. ChAT 발현 정도는 대조군에 비해 PA-J1군과 PA-J2군에서 유의하게 증가하였다.

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Fig. 1

Schematic design of experimental procedures for acupuncture and pharmacopuncture treatment(A) and Morris water maze test(B)

Fig. 2

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of distance(short-term memory) to target on water maze test in occlusion-induced ischemia in rats

A description of controls and experimental groups refer to Table 2.

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

Fig. 3

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of distance(long-term memory) to target on water maze test in occlusion-induced ischemia in rats

A description of controls and experimental groups refer to Table 3.

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

Fig. 4

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the changes of intensity of mGluR5 mRNA in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.05 statistically significant compared with control group.

Fig. 5

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the density of cresyl violet-stained neural cell sections in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.001 statistically significant compared with control group.

Fig. 6

Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1

A; Con group, B; Acu group, C; PA-J1 group, D; PA-J2 group. Cresyl violet-stain. × 40. scale bar; 500 μn.

Fig. 7

Effects of Jodeungsan pharmacopuncture on the density of Choline acetyltransferase (ChAT)-stained sections in the hippocampal CA1

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*: p < 0.001 statistically significant compared with control group.

Fig. 8

Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1

A; Con group, B; Acu group, C; PA-J1 group, D; PA-J2 group. ChAT-stain. × 40. scale bar; 500 μn.

Table 1

Composition of Jodeungsan

Scientific name Amount(g)
CaSO4 · 2H2O 5
Uncaria sinensis (Oliv.) Havil. 3
Pinellia ternata (Thunb.) Breitenbach 3
Citrus unshiu Markovich 3
Poria cocos Wolf 3
Liriope platyphylla Wang et Tang 3
Chrysanthemum indicum Linné 2
Panax ginseng C.A Mey 2
Saposhnikovia divaricata Schischkin 2
Zingiber officinale Roscoe 1
Glycyrrhiza uralensis Fisch. 1

Total 28

Table 2

Changes of Distance(short-term memory) to Target on Water Maze Test in Occlusion-induced Ischemia in Rats after Jodeungsan Pharmacopuncture(cm)

1st 2nd 3rd 4th
Con 32.4 ± 4.12 21.4 ± 5.42 14.6 ± 6.11 14.6 ± 6.74
Acu 30.7 ± 3.80 4.6 ± 1.16* 4.6 ± 1.16 11.3 ± 5.63
PA-J1 25.0 ± 6.98 15.1 ± 3.72 11.3 ± 4.38 18.7 ± 6.88
PA-J2 27.3 ± 5.30 16.1 ± 3.49 8.7 ± 4.12 12.0 ± 5.11

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*

p < 0.05 statistically significant compared with control group.

Table 3

Changes of Distance(long-term memory) to Target on Water Maze Test in Occlusion-induced Ischemia in Rats after Jodeungsan Pharmacopuncture(cm)

2nd 3rd 4th 5th 6th
Con 16.8 ± 4.37 16.5 ± 3.55 8.3 ± 1.38 14.6 ± 3.55 14.8 ± 4.57
Acu 13.4 ± 1.43 10.7 ± 2.84 6.3 ± 1.70 10.1 ± 1.94 10.3 ± 1.76
PA-J1 13.2 ± 1.79 8.9 ± 1.84 4.9 ± 1.22 8.0 ± 2.35 7.2 ± 1.96
PA-J2 14.2 ± 3.04 12.3 ± 3.90 4.7 ± 1.01* 9.2 ± 2.30 7.0 ± 2.23

The results were expressed Mean ± SE; Con: occlusion-induced ischemia and no treatment. Acu: occlusion-induced ischemia and acupuncture. PA-J1, PAJ2: occlusion-induced ischemia and Jodeungsan pharmacopuncture(11.43 mg / 250 g / 40 μℓ, 2.29 mg / 250 g / 40 μℓ).

*

p < 0.05 statistically significant compared with control group.