Ⅰ. 서 론
치매는 사회적 및 직업적인 기능을 수행하는 데 장해가 되는 지적 능력의 황폐화를 지속적으로 초래하는 증상군을 일컫는데[1], 뇌조직의 퇴행, 변성 또는 노화, 중추신경계 감염, 뇌손상, 독성 대사 장애, 혈관성 장애, 신경계 질환 등의 원인으로 인해 발생하며[2], 기억, 사고, 지남력, 이해, 계산, 학습능력, 언어와 판단력을 포함하는 여러 가지 고위대뇌피질 기능의 장애가 나타나게 된다[3].
치매는 병변의 위치에 따라 피질성 치매와 피질하 치매로 나누어볼 수 있는데 피질성 치매에는 대표적으로 알츠하이머성 치매와 혈관성 치매가 있고 피질하 치매에는 대표적으로 파킨슨병, 헌팅턴병을 들 수 있다[4,5]. 이 중에서도 알츠하이머성 치매와 혈관성 치매가 치매 환자의 대부분을 차지하며[6] 특히 최근에는 사회적 발전으로 인한 허혈성 뇌질환의 증가로[7,8] 혈관성 치매의 임상적 중요도가 부각되고 있다.
혈관성 치매는 혈액을 뇌에 공급하는 혈관이 좁아지거나 막혀서 뇌혈류의 장애가 발생하여 유발되는데, 뇌혈류 공급 부족에 의하여 뇌조직이 산소와 포도당 공급을 제한받게 되면, 세포막이 붕괴되고 에너지 생산 과정의 와해로 인해 세포대사의 변화를 초래하게 되고 이에 뇌조직이 손상을 받아 운동장애, 감각장애, 인지장애 등의 복합적인 장애를 일으키게 된다[1]. 혈관성 치매는 전체 치매 환자의 20 % 정도를 차지하며 인성의 황폐화가 일어나 행동이상, 인격 변화를 초래하여 정서적 기능상실과 사회적 또는 직업적 기능의 장애로 인해 정상적인 사회생활을 영위하기 어렵게 만든다[9].
본 실험에 사용한 抑肝散은 薛己의《 保嬰撮要》에 수록된 처방으로“ 治肝經虛熱 抽搐或發熱咬牙 或驚悸寒熱 或木乘土而嘔吐痰涎 腹膨小食 睡臥不安”이라 하여[10] 癎症, 神經症, 神經衰弱, 히스테리, 夜啼, 不眠症 등의 질환을 치료하는데 사용되어 왔으며[11] 최근에는 국내외로 抑肝散의 신경보호 효과에 주목하여 신경퇴행성 질환에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다[12-17].
風池(GB20)는 足少陽膽經의 經穴로 手足少陽經과 陽維脈의 交會穴이며, 목뒤 후두골 아래의 양쪽에 위치하는데 祛風開竅, 解表淸熱하여 頭痛, 耳鳴, 上下肢不遂, 視神經萎縮 등의 증상에 사용된다[18].
이에 저자는 風池(GB20) 抑肝散 약침이 흰쥐의 중대뇌동맥 폐색으로 인한 허혈성 뇌손상에 어떤 영향을 미치는 지를 알아보고자 Morris water maze test와 면역조직화학법을 이용하여 공간기억에 따른 행동 개선과 신경보호작용에 미치는 효과를 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻어 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험 재료
1) 동 물
체중이 약 210 g~230 g의 수컷 Sprague Dawley계의 흰쥐들을 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24 ± 1 ℃, 습도 60 ± 5 %) 내에서 고형사료(pellet, Samyang, Korea)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 1주일 이상 적응시킨 다음 실험에 사용하였으며, 실험 기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취시켰다.
본 실험은 동신대학교 동물실험윤리위원회(No.2015-09-02)의 승인을 받아 시행하였다.
2) 약침액 조제
동신대학교 부속 순천한방병원에서 구입한 抑肝散의 구성약물(Table 1)을 1첩(23 g) 당 1,000 ㎖의 1차 증류수와 함께 100 ℃에서 약 150분간 열수 추출하여 350 ml의 전탕액을 얻었으며, 이 전탕액을 원심분리기(Vision 6000CFI, Korea)로 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액은 rotary evaporator (Buchi, Netherlands)로 수분을 증발시켜 100 ㎖로 감압 농축하였으며, 농축액을 동결건조기(Samwon, Korea)로 -70 ℃에서 동결건조시켜 최종적으로 얻어진 원료의 양은 18 g이었다. 원료를 소분하여 생리식염수로 희석하였고, pH meter(ORION, USA)를 사용하여 산도를 각각 pH 7로 조절하여 조제한 후 냉장 보관한 다음 시술에 사용하였다.
2. 실험 방법
1) Middle Cerebral Artery Occlusion(MC AO)에 의한 허혈성 국소 뇌손상 유발
국소 뇌허혈은 Longa 등[19]의 방법에 따라 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 유발하였다. 흰쥐에 80 % O2에 5 % isoflurane(Hana Pharm, Korea)을 이용하여 흡입마취를 유도하고 2 % isoflurane으로 마취를 유지하였다. 좌측 중대뇌동맥을 폐색하기 위해 경부 정중선을 따라서 피부를 절개하고 흉골설골근(sternohyoid muscle)과 흉골갑상근(sternothyroid muscle) 사이에 좌측 총경동맥을 노출하여 좌측 내경동맥의 원위부를 최대한 확보한 후 미세혈관 클립(WPI, USA)을 이용하여 결찰하고, 좌측 내경동맥과 intraluminal filament(직경 0.28 mm rounded tip) 사이의 출혈을 방지하기 위하여 6-0 silk suture를 이용하여 좌측 총경동맥 근위부 및 좌측 외경동맥 분지부를 결찰하였다. 좌측 총경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측내경동맥 분지부에서 1 ㎝정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(WPI, USA)를 사용하여 혈관을 절제하고, 미세혈관 클립 또한 제거한 후 좌측 내경동맥 내로 20 ㎜의 치과 인상제(Durelon, Germany)가 발라진 intraluminal filament를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때 까지 약 17 ㎜ 깊이로 부드럽게 삽입한 후, 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하여 좌측 중대뇌동맥 부위에 국소 허혈을 유발하였다. 그 후 출혈 방지를 위해 좌측 내경동맥상의 intraluminal filament 삽입 부위를 가볍게 묶고 절개된 피부를 봉합하였다.
2) 군 분리 및 시술
군 분리는 Ischemia 유발 후 무처치한 대조군(Con, n = 5)과 Ischemia 유발 후 抑肝散 약침은 시행하지 않고 風池(GB20)에 단자한 침자군(Acu, n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 抑肝散 약침 2.571 ㎎/ 250 g/ 40 ㎕을 시술한 U-PA1군(n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 抑肝散 약침 6.428 ㎎/ 250 g/ 40 ㎕을 시술한 U-PA2군(n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 抑肝散 약침 12.855 ㎎/ 250 g/ 40 ㎕을 시술한 U-PA3군(n = 5)의 총 5군으로 분리하였다.
각 군의 약침액 농도는 70 kg의 성인이 복용하는 양을 250 g의 흰쥐 기준으로 환산하여 1 : 2.5 : 5의 비율로 나누었다.
3) 취혈 및 시술
風池(GB20)는 occipital bone의 아랫면에서 흉쇄유돌근과 승모근 사이의 오목한 곳으로 인체 상응하는 부위로 정하였으며[19], 자침 및 약침 시술은 insulin syringe (31G × 8 mm, BD, USA)를 이용하여 2일에 1회씩 총 6회에 걸쳐 이루어졌고, 자침의 경우 약침은 적용하지 않고 風池(GB20)만 단자하였으며 약침 시술의 경우 風池(GB20) 양측에 각각 20 ㎕의 약침을 주입하였다.
4) Morris water maze test
Morris water maze test를 위하여 원형수조(117 × 50 cm)에 물을 채우고, 물의 온도는 24 ± 1 ℃의 적정 온도를 유지하고, 실험 공간의 밝기는 전체가 어두운 환경에서 4분면을 정하여 간접 조명하고, 수조 안에 platform(20 × 32 cm)을 설치하였다.
Morris water maze test는 총 6차례 이루어졌으며, 각 차수마다 훈련을 4회 실시하였다. 수조를 4등분하여 1차부터 6차까지 platform을 같은 4분면에 두었으며, 수조 테두리에 방위를 표시하여 매회마다 30초 간격을 두고 수영 시작 지점을 다르게 하였다. 한 차수에서 4회 반복 수영하는 과정 중 분 안에 찾지 못하면 위치를 기억할 수 있도록 platform 위에 올려 15초 동안 주위를 관찰하도록 하여 인지를 시키고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다. 1 분 안에 platform을 찾아 올라가면 그 순간부터 15초 동안 platform에서 주위를 관찰하도록 두었고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다.
Water maze test는 자침 및 약침 처치 다음날 실시하였으며 총 6차에 걸쳐 시행하였고, test는 흰쥐를 원형수조에 넣고 platform을 찾아가기까지 걸린 시간과 거리를 측정하였다. 본 실험에서는 1차에서 1회 훈련을 제외하고 2회 훈련부터 4회 훈련을 단기 기억으로 보았고, 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기 기억으로 보았다.
5) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
(1) Total RNA 분리
적출된 뇌는 바로 액체 질소에 급속 냉동시키고 분석하기 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. Total RNA의 분리는 뇌 조직(300 ㎎)을 800 ㎕ Tripure Isolation Reagent (Roche, Germany)로 균질화하고 균질액에 대해 200 ㎕의 chloroform(Sigma, USA)을 가하여 15초 동안 흔들어 잘 혼합한 후 실온상태에서 5분 동안 둔 다음 세포 유잔물을 제거하기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상층액과 500 ㎕ 의 isopropanol( sigma, USA)을 첨가하여 실온상태에서 5분 동안 둔 후 RNA pellet을 얻기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리로 생긴 pellet은 냉장 보관된 70 % ethanol과 함께 DEPC를 넣고 4 ℃, 7,500 rpm에서 5분간 원심분리하였고, 그 후 pellet만 남기고 모두 제거하고 남은 ethanol은 실온에서 5분간 두어 건조시킨 다음 DEPC-treated water에 녹여 spectrophotometer(Eppendorf, Germany)에서 OD260 값을 읽어 RNA의 순도 및 농도를 정량하였다.
(2) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
분리된 total RNA 5 ㎍과 2.5 ㎕ Oligo (dT), DEPC-treated water를 RT premix(Bioneer, Korea)에 넣어 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)를 이용하여 50 ㎕ cDNA를 합성하여 PCR 증폭을 위한 template로 사용하였고, 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) (sense primer: 5'-ACTCCATCACCATCTTCCAG-3', antisense primer: 5'-CCTGCTTTCACCACCTCCTTG-3')를 internal control로 사용하였다. Reverse transcription temperature cycle은 42 ℃에서 1시간 동안 cDNA synthesis, 94 ℃에서 5분 동안 denature 그리고 4 ℃에서 5분 동안 cooling시키는 단계를 거쳤다. Polymerase chain reaction은 cDNA, 10pg sense primer , 10pg antisense primer, DEPC-treated water를 PCR premix(Bioneer, Korea)에 넣었다. PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95 ℃에서 300초 동안 pre-denaturation, 94 ℃에서 40초 동안 melting, 55 ℃에서 40초 동안 annealing, 72 ℃에서 90초 동안 extension하는 과정을 34회 반복 수행하고, 마지막 cycle에서 72 ℃에서 600초 동안 extension 단계를 거쳐 Bax 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-CATCTTCTTCCAGATGGTGA-3', antisense primer: 5'-GTTTCATCC AGGATCGAGCAG-3'), Bcl2 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-CGGTTCAGGTACTCAGTCAT-3', antisense primer: 5'-ACTTTGCACAGATGTCCAGT-3'), mGluR5 유전자증폭은 primer(senseprimer: 5'-TCCAATCTGCTCCTCC TACC-3', antisense primer: 5'-CAACGATGAAGAACTCT GCG-3')를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 시행하였다. 이렇게 증폭된 Bax, Bcl2, mGluR5의 DNA를 Greenview nucleic acid gel stain(IO Rodeo, 1 : 10,000)를 포함한 1.5 % agarose gel상에서 0.5x TBE buffer (80 mM Tris-HCL, 80 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3)로 100 V에서 전기 영동시켜 관찰한 후 Image Station(Kodak, Japan)을 이용하여 촬영하였으며, Alphaease FC StandAlone Software(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
6) Immunohistochemistry
(1) Cresyl violet 염색
모든 실험이 끝난 직후 흰쥐를 Urethane(25 %, Sigma, USA)으로 마취시킨 후, 0.9 % saline 200 ㎖에 이어, phosphate buffer로 준비한 5 % formalin 용액(fixative) 800 ㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200 ㎖는 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800 ㎖는 천천히 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 10 % formalin 용액으로 고정시키고, 30 % sucrose가 함유된 phosphate buffered saline(PBS)에 넣어 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 다음 날 뇌를 급속 냉동한 후에 뇌 조직의 hippocampus 부위를 30 ㎛의 두께로 자른 후, PBS로 조직을 몇 차례 세척하고 순서대로 xylene(5 min), 100 % alcohol(2 min), 95 % alcohol(1 min), 70 % alcohol(1 min), D.W.(2 min)에 옮겨 담아 탈지, 탈수를 시킨 후 cresyl violet buffer(5 min)로 염색을 하였다. 염색이 끝난 다음, 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 통해 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program( Scion Corp. MD, USA)을 사용하여 분석하였다.
(2) Choline acetyltransferase(ChAT)
뇌 조직은 초기에 0.1 M PBS에 3 회 정도 세척하였고, 2 % 토끼 혈청으로 30분 blocking한 후, 각각 ChAT antibody( 1 : 500, monoclonal, Millipore, USA)를 사용하였다. 1 차 항체는 0.1 M PBS에 0.1 % sodium azide(Sigma, St. Louis, MO, USA) buffer로 500배 희석하여 준비하였다. 뇌 조직은 1차 항혈청에 4 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 3번 이상 조직을 0.1 M PBS로 세척한 다음 biotinylated universal Secondary Antibody(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 0.1M PBS로 3번 세척한 다음, 뇌 조직은 37 ℃에서 30분 동안 Streptavidin peroxidase preformed complex(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 담갔다. 0.1 M PBS로 3번 세척한 다음 조직을 착색제로서 diaminobenzidine(DAB)을 사용하여 발현시키고, 0.1 M PB로 발색을 정지시켰다. 슬라이드를 dehydtration한 후에 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 통해 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 사용하여 분석하였다.
Ⅲ. 결 과
3. Bax 발현에 미치는 영향
風池(GB20) 抑肝散 약침이 hippocampal CA1 부위의 Bax 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 121.7± 3.36( ×1000 O.D.), Acu군은 108.2 ± 6.34(× 1000 O.D.), U-PA1군은 98.5 ± 6.94(× 1000 O.D.), U-PA2군은 89.5 ± 5.82(× 1000 O.D.), U-PA3군은 98.3 ± 8.74(× 1000 O.D.)를 각각 나타내었다.
대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군과 U-PA3군이 유의하게 감소하였다(p < 0.05)(Fig. 3).
4. Bcl-2 발현에 미치는 영향
風池(GB20) 抑肝散 약침이 hippocampal CA1 부위의 Bcl-2 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 109.3 ± 8.31(× 1000 O.D.), Acu군은 118.4 ± 8.18(×1000 O.D.), U-PA1군은 108.8 ± 10.98(× 1000 O.D.), U-PA2군은 112.0 ± 9.63(× 1000 O.D.), U-PA3군은 117.3 ± 7.28(× 1000 O.D.)을 각각 나타내었다.
대조군에 비해 모든 실험군들에서 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 4).
5. Bax/Bcl-2 ratio에 미치는 영향
風池(GB20) 抑肝散 약침이 hippocampal CA1 부위의 Bax/Bcl-2 ratio에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 1.1 ± 0.11, Acu군은 0.9 ± 0.11, U-PA1군은 1.0 ± 0.15, U-PA2군은 0.8 ± 0.11, U-PA3군은 0.8 ± 0.08을 각각 나타내었다.
대조군에 비해 U-PA3군이 유의하게 감소하였다(p < 0.05)(Fig. 5).
6. mGluR5 발현에 미치는 영향
風池(GB20) 抑肝散 약침이 hippocampal CA1 부위의 mGluR5 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 103.1 ± 10.31(× 1000 O.D.), Acu군은 124.8 ± 4.37(× 1000 O.D.), U-PA1군은 124.1 ± 5.83(× 1000 O.D.), U-PA2군은 109.3 ± 9.05(× 1000 O.D.), U-PA3군은 124.4 ± 11.07(× 1000 O.D.)을 각각 나타내었다.
대조군에 비해 모든 실험군들에서 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 6).
7. 신경세포 손상 방어 효과에 미치는 영향
風池(GB20) 抑肝散 약침이 hippocampal CA1 부위의 cresyl violet으로 염색된 신경세포의 밀도에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 20.4 ± 0.61(density), Acu군은 21.3 ± 0.51(density), U-PA1군은 26.0 ± 1.26(density), U-PA2군은 24.5 ± 1.29(density), U-PA3군은 25.3 ± 1.44(density)를 각각 나타내었다.
Ⅳ. 고 찰
치매는 뇌의 기질적 병변에 의해 기억장애 및 기타 지적 기능의 상실이 일어나는 임상증후군을 이르는 것으로 지적 황폐화와 함께 행동 이상 및 인격 변화를 일으키며, 정서적 기능상실과 진행성인 지적 황폐화가 나타나 사회적 혹은 직업적 기능의 장애를 초래하게 된다[6].
치매는 뇌의 퇴행성 변화, 뇌혈관 장애, 뇌의 염증성 장애, 대사성 질환, 내분비 질환, 외상 등으로 인해 나타나며[20], 이 중 알츠하이머성 치매와 혈관성 치매가 많은 비율을 차지하고 있는데[6], 알츠하이머성 치매는 뇌의 neuron에 β-amyloid 단백질이 침적되어 신경독성으로 신경세포사를 일으키거나 또는 과인산화 tau 단백질이 침적되어 심경섬유성 엉킴 작용을 일으켜 나타나는 신경퇴행성 현상을 말하고[21], 혈관성 치매는 뇌혈관의 병변으로 인한 뇌의 기질성 장애로 인해 나타나게 되는 임상증후군을 일컫는다[6]. 최근에는 경제적인 발전에 뒤따른 서구화된 식습관, 음주와 흡연율 증가 등으로 고혈압, 당뇨, 비만, 고지혈증 등의 생활습관병의 발병률이 높아져 허혈성 뇌혈관 질환이 증가하는 추세를 보이는데[8,9], 이에 따라 혈관성 치매의 중요도가 높아지고 있다.
혈관성 치매는 전체 치매의 약 20 %를 차지하고 알츠하이머형 치매와는 달리 발병이 갑작스럽고 장기간에 걸쳐 호전과 악화를 반복하는 계단식 경과로 나타나며 국소적인 신경학적 이상 소견을 보인다[22]. 또한 우리나라와 일본에서는 서구보다 혈관성 치매의 발병률이 더 높은 것으로 알려져 있으며 전체 치매의 약 50~60 %를 차지하고 있는 알츠하이머형 치매에서도 혈관성 병인이 있다고 밝혀지면서 혈관성 치매는 임상적으로 중요한 위치에 있다[23,24].
혈관성 치매는 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 심장질환 등 뇌혈관 질환의 발생 또는 악화시키는 혈관성 요인에 대한 치료 및 관리가 매우 중요하며, 현대의학에서는 Donepezil, Galantamine, Rivastigmine, Memantine 등이 사용되고 있으며 특히 Donepezil의 효과가 주목받고 있다[25].
치매는 한의학에서 痴, 癲狂, 健忘, 虛勞 등의 범주에 포함되며[26], 병인으로는 老年體虛, 情志失調, 飮食失調, 中毒外傷, 他病으로 크게 나누어 볼 수 있고, 병기로는 肝腎不足, 氣血虧虛, 痰濁阻竅, 氣滯血瘀로 구분되어 있다[6].
抑肝散은 淸代 薛己의《 保撮要》[10]에 최초로 기재된 처방이며 肝經虛熱을 消肝火熱, 淸熱鎭痙의 효능으로 다스려 肝火가 旺盛하여 생기는 흥분을 진정시킨다는 뜻에서 명명된 것으로27) 當歸, 白朮, 白茯苓, 釣鉤藤, 川芎, 柴胡, 甘草로 이루어져있다.《 保撮要》[10]에 의하면 抽, 發熱咬牙, 口眼斜, 腹脹少食, 睡臥不安 등을 치료한다고 기록되어 있으며, 癎症, 神經症, 神經衰弱, 히스테리, 夜啼, 不眠症 등의 질환을 치료하는데 응용되어 왔다[11].
최근에는 국내외에서 抑肝散의 신경보호 효과에 주목하여 신경퇴행성 질환에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 정[12]은 파킨슨병을 유발한 생쥐 모델에서 抑肝散을 구강 투여하여 쥐의 운동 기능 증진 효과와 세포독성에 대한 보호 효과가 있는 것을 보고하였고, 조 등[13]은 CoCl2로 C6 신경교세포의 세포 사멸을 유도한 다음 抑肝散을 처리하여 세포 사멸에 대한 보호 효과가 있음을 보고하였고, 두 등[14]은 抑肝散이 1-methyl-4-phenylpyridine/1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine으로 유도된 세포독성에서 유의한 신경보호 효과가 있음을 보고하였고, Lizuka 등[15]은 티아민이 결핍된 쥐 모델의 뇌세포 퇴행에 대한 抑肝散의 효과를 전자현미경적으로 밝혀내 보고하였고, Nogami 등[16]은 뇌허혈을 반복적으로 발생시킨 쥐 모델에서 抑肝散을 경구 투여하였을 때 해마 에서 아세틸콜린 분비를 증가시키고 뉴런세포의 자멸사를 막아 공간 기억 장애를 개선하는 효과가 있음을 보고하였으며, Liu 등[17]은 상호 총경동맥을 폐색시켜 뇌의 허혈성 손상을 유발한 게르빌루스 쥐의 행동장애를 抑肝散을 통해 개선하였다고 보고하였다.
Intraluminal filament 삽입술은 일측 내경동맥에 filament를 삽입하여 중대뇌동맥의 폐색을 유발하는 방법으로 두개골 절개가 필요 없고, 전뇌만 국한적으로 허혈 상태를 유발하여 후뇌의 혈류가 영향을 받지 않아 호흡과 체순환에 영향을 주지 않게 되어 실험 모델의 생존율을 높일 수 있어 국소적 뇌허혈 유발의 실험 모델로 자주 쓰이는 방법이다[28].
取穴은 足少陽膽經의 經穴로 祛風開竅, 解表淸熱하여 頭痛, 耳鳴, 上下肢不遂, 視神經萎縮 등의 증상에 상용되는 風池(GB20)를 택하였고[19], 자침 및 약침 시술은 MCAO를 시행한 3일 후에 시작하였는데, 흰쥐에 뇌허혈을 유발하고 재관류하였을 때 해마의 CA1 부위의 신경세포들이 재관류 72시간 후에 죽기 시작한다는 것과[29], 시술 직후 쥐가 받는 스트레스를 고려하였다.
이와 같은 기존 연구를 토대로 風池(GB20) 抑肝散 약침이 국소 뇌손상 유발 흰쥐 모델의 인지장애에 미치는 영향을 알아보고자 Morris water maze test를 시행하고 hippocampus의 Bax, Bcl-2, Bax/Bcl-2 ratio, mGluR5, Density of cresyl violet-stained neural cell, ChAT를 관찰하였다.
Morris Water Maze는 동물의 공간 기억 능력을 측정하기 위해 사용되는 장치로 물로 채워진 원통형 수조 내에 platform을 설치하고, 근접단서나 냄새와 같은 추적단서를 배제한 뒤 주어진 단서들을 배열하여 자신의 위치를 학습하여 숨겨진 platform을 찾게 되는데, 이 과정에서 동물의 공간 기억 능력을 검사할 수 있다[30].
본 실험에서는 자침 및 風池(GB20) 抑肝散 약침을 시술한 다음 날 훈련을 시행하여 총 6차례에 걸쳐 이루어졌는데 각 차수별로 총 4회의 훈련이 이루어졌으며, 정 등[31]의 연구를 참고하여 1차 훈련 시 1회를 제외한 2회에서 4회까지의 훈련을 단기 기억으로 보았고, 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기 기억으로 구별하여 평가하였다.
단기 기억에서는 대조군에 비해 모두 platform에 도달하는 시간이 감소하는 경향을 보였는데 Acu군의 2회, 3회, 4회 차에서 유의한 감소를 보였고, U-PA3에서는 3회 차에서 유의한 감소를 보인 것으로 보아 風池(GB20) 抑肝散 약침이 단기 기억에 대한 기억력 회복 효과를 발휘하였으나 단기 기억의 측면에 있어서는 Acu군에서 특히 두드러진 감소를 보여 침을 시술한 군이 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
장기 기억에서는 U-PA1군이 3차, 4차에서 대조군보다 platform에 도달하는 시간이 증가하였으나, 나머지 항목에서는 대조군에 비해 Acu군과 抑肝散 약침군들에서 시간이 감소하여 나타났다. 특히 대조군에 비하여 U-PA2군의 5차, 6차에서 유의한 감소가 일어났으며, 3차 훈련 이후로 모든 군에서 지연 시간이 이전 훈련보다 오히려 늘어나는 경향을 보이는데 이는 Diamond 등[32]의 연구 결과로 보아 장기간 stress 유발 환경에 노출되어 해마가 손상되어 공간 기억 능력이 저하된 것으로 판단된다.
Bax(Bcl-2 Antagonist X)는 세포자멸사 과정에서 중요한 역할을 담당하는 인자로 신경세포의 사멸, 림프계 및 생식기관의 항상성 유지, 종양 억제, DNA 손상에 이은 세포사, 허혈-재관류 손상 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, Bcl-2는 사립체 막에서 Bax의 소중합체형성을 억제하여 자멸사를 막는 작용을 하는데, Bax와 Bcl-2는 서로 이형이합체를 이루어 미세한 발현의 차이를 통해 세포 자멸사를 조절한다[33].
본 연구에서 각 군의 해마 부위 Bax 발현 정도는 대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군, U-PA3군에서 유의하게 감소하였으며(p < 0.05) 그 정도는 U-PA2군에서 가장 유의한 효과를 보여 약침의 농도별 의존도는 보이지 않는 것으로 나타났고, Bcl-2 발현에 있어서는 Acu군, U-PA2, U-PA3군에서 증가를 보였으나 유의성은 없는 것으로 나타났으며, 각 군의 해마 부위의 Bax/Bcl-2 ratio를 관찰한 결과로는 대조군에 비해 U-PA3군에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다.(p < 0.05) 이는 風池(GB20) 抑肝散 약침이 Bax 발현을 감소시키나 Bcl-2에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 생각되며, Bax가 감소됨에 따라 Bax/Bcl-2 ratio 또한 감소되어 뇌허혈로 인한 세포자멸사를 억제하는 효과가 있는 것으로 생각되는데 비교적 U-PA3군에서 Bcl-2가 높게 측정되었기 때문에 Bax/Bcl-2 ratio 측면에서는 U-PA3군에서 가장 효과가 좋았던 것으로 사료된다.
Glutamate는 중추신경계에서 가장 많이 분포하는 주요한 흥분성 신경전달 물질로[20] 허혈성 뇌손상에서 강력한 독성을 일으켜 세포막 인지질의 파괴를 촉진시키고 신경세포 손상을 일으키게 된다. mGluR5(metabotropic Glutamate Receptors)는 해마 CA1구역 추체신경세포에 발현되는 주요한 glutamate receptor로 산소 결핍이나 NO 독성에 대한 신경보호 및 신경조직 형성에 유효한 작용을 나타낸다[34].
본 연구에서 나타난 mGluR5의 변화를 살펴보면 대조군과 비교했을 때 모든 군에서 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 없는 것으로 나타나 風池(GB20) 抑肝散 약침이 mGluR5의 발현에는 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다.
해마는 대뇌의 관자엽 안쪽에 위치하며, 학습과 기억에 관여하고 감정 행동 및 일부 운동을 조절하는 역할을 하는데, 뇌가 발생하고 분화하는 시기 이후에도 신경세포가 분열하며, 기억장애와 관계되는 구심성 및 원심성 신경섬유가 많이 연결되어 있다[35]. 해마는 변연계 중 핵심적인 신경구조로 세포구축학적으로 CA1(Cornu Ammonis), CA2, CA3, CA4 세포영역과 치상회 세포영역으로 이루어져 있는데, 이 중 해마지각에 가까우면서 가장 넓은 쪽이 CA1 영역이며 신경세포의 자멸사는 주로 해마 CA1의 추체신경세포총에서 일어나고 단기간의 뇌허혈 후 재관류는 이곳의 괴사를 유발하는 것으로 알려져 있다[36,37].
각 군의 해마 CA1 부위를 Cresyl violet에 염색하여 신경세포 손상에 대한 방어 효과를 관찰한 결과, 대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군, U-PA3군에서 유의하게 증가하여 (p < 0.05) 風池(GB20) 抑肝散 약침이 뇌허혈로 유발된 신경세포의 손상을 억제한 것으로 보인다.
ChAT(choline acetyltransferase)는 choline과 acetyl-CoA 간의 반응을 촉진하여 아세틸콜린을 합성하는 효소로 기억, 학습, 수면 등 기본적인 뇌 기능을 수행하는데 있어 콜린신경계의 신경발달 및 활동과 관련하여 중요한 역할을 담당하고 콜린성신경계가 퇴행하면 ChAT의 활성이 감소되며 특히 해마에서 가장 많이 나타난다[38]. ChAT의 활성이 증가하면 아세틸콜린 합성능력이 향상되어 인지 및 기억력 장애 해소에 효과가 있을 것으로 판단된다.
각 군의 해마 CA1 부위 ChAT의 발현 정도를 관찰한 결과 대조군에 비해 U-PA1군(p < 0.05), U-PA2군(p < 0.05)과 U-PA3군(p < 0.001)이 유의하게 증가하여 風池(GB20) 抑肝散 약침이 choline성 신경섬유의 기능 회복에 유의한 작용을 한 것으로 보인다.
이상과 같은 결과에서 보면, Morris water maze를 이용한 행동학적 변화에 있어 단기 기억 및 장기 기억에서 유효한 회복이 관찰되었고, Bax 발현, Bax/Bcl-2 ratio, 신경세포 밀도, ChAT 발현에 유의한 영향이 있는 것으로 나타나 風池(GB20) 抑肝散 약침이 뇌허혈로 유발된 신경세포 손상을 보호하고 세포자멸사를 막는 역할을 수행하는데 유효할 것이라고 생각된다. 그러나 단기 기억에서는 자침군(Acu)에서 더 뛰어난 효과를 보였는데 이는 혈관성 치매에 침치료를 시행해 볼 수 있는 하나의 단서가 되며 김[39]의 연구를 토대로 임상에서 혈관성 치매에 이미 침치료를 활용하고 있음을 보아 抑肝散 약침과 병행하여 침치료를 활용하면 혈관성 치매에 대한 유의한 호전을 기대할 수 있을 것이다. 또한 실험 결과, U-PA3군이 단기 기억, Bax 발현, Bax/Bcl-2 ratio, 신경세포 밀도, ChAT의 다섯 가지 항목에서 유의성을 보임으로써 어느 정도 농도가 실험 결과에 영향을 미쳤음을 관찰할 수 있었으나, 각 항목에 대한 유의성이 농도에 비례하는 결과를 보이지는 않았기 때문에 최적의 농도를 알아보기 위한 차후의 연구가 필요하다고 사료된다.
Ⅴ. 결 론
風池(GB20) 抑肝散 약침이 중대뇌동맥 폐쇄로 유발된 국소 뇌손상 흰쥐 모델에 미치는 영향을 실험적으로 알아보고자 Morris water maze를 이용한 행동학적 변화와 신경세포 손상에 의한 효과를 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. Morris water maze test에서 抑肝散 약침이 단기기억에 미치는 영향은 Acu군에서 2회, 3회, 4 회차에 유의한 감소를 보였고, U-PA3군에서 3 회차에서 유의한 감소를 보였으며, 장기 기억에 미치는 영향은 U-PA2군에서 5차, 6차에 유의한 감소를 보였다.
2. Bax 발현 정도는 대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군, U-PA3군에서 유의하게 감소하였다.
3. Bax/Bcl-2 ratio는 대조군에 비해 U-PA3에서 유의하게 감소하였다.
4. Cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상방어 효과는 대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군, U-PA3군에서 유의하게 증가하였다.
5. ChAT 발현 정도는 대조군에 비해 U-PA1군, U-PA2군, U-PA3군에서 유의하게 증가하였다.
이상의 결과로 보아 風池(GB20) 抑肝散 약침이 허혈성 뇌손상으로 인한 인지 및 기억 장애를 개선시키고 뇌신경세포 손상을 억제하며 세포자멸사를 억제시키는데 효과적일 것으로 사료된다.
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