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J Acupunct Res > Volume 31(4); 2014 > Article
Shin, Lee, Lim, Lee, Lee, Jung, and Kim: The Protective Effects of Acupuncture on the Liver in the Oxidative Stress Caused by Cadmium

Abstract

This study was performed to investigate the protective effects of acupuncture on the liver in the oxidative stress caused by cadmium accumulation.
Sprague-Dawley male(150 ± 30 g) rats were stabilized for a week and divided into 5 groups which is normal, control, LR3 acupuncture, BL23 acupuncture and sham acupuncture group. For three days experimental groups were received oral doses of cadmium 2 mg/kg twice a day. Acupuncture was given bilaterally at each point 10 times for two weeks. The depth of stimulation was 1 mm at right angles and torsion of acupuncture was produced 2 times per second for 1 minutes. The liver was shipped off and taken weight at the last day of two weeks, and hepatic functions was confirmed through alanine transaminase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST). We measured reactive oxygen species of serum, liver and kidney, and compared expression levels of superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione peroxidase(Gpx), nuclear factor erythroid derived 2-related factor 2(Nrf-2), heme oxygenase-1(HO-1), nuclear factor-κB (NF-κB), cyclooxygenase-2(COX-2), inducible nitric oxide synthase(iNOS), Bax and Cytochrome c. BL23 acupuncture group significantly increased liver weight and decreased ALT compared to control group. For the oxidative stress, LR3 acupuncture group significantly reduced reactive oxygen species, and BL23 acupuncture group significantly reduced reactive oxygen species and inflammation-related protein compared to control group. But LR3 acupuncture group and BL23 acupuncture group didn’t significantly reduce apoptosis-related protein.
Therefore LR3 and BL23 acupuncture showed the effects of antioxidant and anti-inflammatory, especially BL23 acupuncture was more effective than LR3 acupuncture on the protection of liver in the oxidative stress.

서 론

현대 사회는 산업 발달에 수반되는 공해로 인해 카드뮴, 납, 수은, 비소 등과 같은 중금속 화합물에 의한 대기, 토양, 식수 등의 환경오염과 이로 유발되는 2차적인 식품오염 등으 로 심각한 사회문제를 겪고 있다1). 이 중 카드뮴(cadmium, 이하 Cd)은 주로 호흡기나 소화기를 통하여 체내에 유입되 며, 체내에서 10~30년의 긴 생물학적 반감기를 가지고 있어 먹이 연쇄에 의하여 계속 축적되고 이에 따라 그 독성도 누적 된다2).
카드뮴 독성의 정도는 개체의 영양 상태, 연령, 폭로 기간, 체내 침입 경로, 카드뮴염의 형태 등에 따라 다른데3,4), 일반 적으로 신 기능장애, 간 조직손상, 중추신경 장애, 고혈압, 빈혈, 골연화증 등을 유발하는 것으로 알려져 있으며5,6), 발 암작용도 일으킨다고 보고되었다7).
산화ㆍ환원 비활성 금속인 카드뮴은 지질 및 세포막, 단백 질 및 핵산 등의 세포 구조 손상에 중요한 매개체가 될 수 있 는 활성산소(reactive oxygen species, 이하 ROS) 생산을 유도하여 산화적 스트레스를 일으키고8,9), 미토콘드리아 기 능 장애를 가져와 결국 세포사멸에 이르게 한다10).
중금속 해독에 대한 다양한 약재와 식품들의 경구 식이 및 투여 또는 복강 투여에 대한 연구가 많이 진행되었고11-16), 약침을 사용하여 중금속으로 인한 간과 신장의 손상을 억제 하는 연구도 있으나17,18), 현재 경혈의 침 자극에 의한 해독 연구방법은 전무한 상태이다.
한의학에서는 코카인과 모르핀 및 알코올 중독의 침치료 에 대한 연구가 활발히 진행되고 있어 중금속 중독에 대한 해 독 침 자극의 가능성을 제시할 수 있고19-21), 여러 중독을 해 독하는 경혈에 관한 문헌 연구도 이루어져 있다22,23). 그 중 태충혈은 간 손상을 보호하고 세포사멸을 방지하며 신경손상 을 회복시키는 작용을 하고24,25), 신수혈은 신장의 기능을 자 극하고 모르핀을 해독시키는 작용을 한다26,27).
이에 본 연구는 동물실험을 통하여 카드뮴의 주요한 표적 장기이며, 급성 폭로 시 다량으로 축적되는 간 조직에 침 자 극이 미치는 항산화, 항염증, 세포사멸 보호 효과에 대해 약 간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 재료

1) 동물

실험동물은 체중 150 ± 30 g의 Sprague-Dawley계 흰쥐 수컷 4주령(효창 사이언스, 대구, 대한민국)을 사용하였다. 실험실 환경은 온도 20 °C, 습도 55 %로 유지하고 cage 당 4마 리씩 넣어서 일주일동안 실험용 펠레트 사료(신촌사료주식회 사, 서울, 대한민국)의 수분을 공급하여 안정화시킨 후 사용 하였다. 본 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리규정을 준 수하여 시행하였다(DHU2013-064).

2)

침은 스테인레스 호침(직경 0.18 mm 길이 3.0 mm, 동방침 구, 한국)을 사용하였다.

3) 시약

Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare(Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, β-actin, superoxide dismutase(이하 SOD), catalase, glutathione peroxidase(이하 Gpx), p22phox(phagocyteoxidase), nuclear factor erythroid derived 2-related factor 2(이하 Nrf-2), heme oxygenase-1(이하 HO-1), nuclear factor-κB(이하 NF-κB), cyclooxygenase-2(이하 COX-2), inducible nitric oxide synthase(이하 iNOS), Bax, cytochrome c 항 체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로 부터 구입하였으며, NADPH oxidase(Nox)-4는 Life Span Bio Sciences(Seattle, WA, USA)로부터 구입하였다. 그리 고 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) 는 Molecular Probe, Inc(Eugene, OR, USA)에서 구입하였 다. 혈청 alanine transaminase(이하 ALT)와 aspartate aminotransferase(이하 AST) assay kit은 Sentron GmbH (Dresden, Germany)에서 구입하였으며, 그 외의 모든 시약 은 Sigma(St Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

2. 방법

1) 군 분류

1주일간의 적응기를 둔 후 카드뮴을 투여하지 않은 정상군 과 카드뮴을 투여한 실험군으로 나누고, 카드뮴 투여 실험군 은 다시 아무런 침 자극을 하지 않은 대조군, 태충혈에 침 자 극한 태충혈군, 신수혈에 침 자극한 신수혈군 그리고 꼬리에 침 자극한 꼬리침군으로 나누었다. 실험동물은 각 군별로 10마 리씩 총 50마리를 사용하였고, 6마리 이하로 감소하면 2차 실험을 다시 시행하였으며, 2차 실험은 1차 실험과 동일하게 진행하였다.

2) 침 자극

침 자극은 동물 아틀라스에 해당되는 태충ㆍ신수혈을 찾아 펜으로 점을 찍고 양쪽으로 자극하며, 꼬리침군은 혈 자리 이 외의 침 자극으로 인해 발생할 수 있는 해독 효능을 배제하기 위하여 흰 쥐 꼬리 부분의 sham 경혈을 잡아 자극하였다. 침 자극은 주 5회 2주간 실시하는데, 자극의 깊이는 1 mm 직각으 로 자입하여 1분 동안 1초당 2번 염전하였고, 활동할 수 있는 흰 쥐에 침 자극을 하면 스트레스로 인해 침의 효과에 영향을 끼칠 수 있으므로 마취 후 시행하였다.

3) 카드뮴 축적 흰쥐 모델

카드뮴은 체중에 따라 2 mg/kg로 1일 2회 오전, 오후 연속 3일간 경구 투여하였다. 침 자극 2주의 최종일에는 12시간동 안 절식시킨 후 에테르로 마취시켜 개복하고 복부대정맥에 관류하여 채혈투여 종료 후 마취상태에서 심장천자를 통해 흰 쥐의 모든 혈액을 채취하였고, 간은 빠르게 적출하여 액체 질소에 냉동한 뒤 –80 °C에서 보관하였다.

4) 체중 및 장기 무게 측정

실험 전 물은 자유롭게 공급하면서 약 16시간 동안 절식한 후 체중을 측정하였으며, 체중증가(g)는 침 자극 0일의 체중 과 침 자극 최종일의 차이로 나타내었다. 또한, 장기의 중량 은 침 자극 최종일에 실험동물의 간을 적출하여 무게를 측정 하였으며, 기관의 무게를 체중으로 나눈 간의 index값은 침 자극 최종일의 체중에 대한 백분율(%)로 나타내었다.

5) 혈청 분석

복부대정맥에서 채혈한 혈액을 5417R microcentrifuge (Eppedorf Co, Hamburg, Germany)를 이용하여 원심분리 후 혈청을 얻었다. 혈청 ALT, AST assay kit는 제작사 (Shinyang Chemical Co)의 프로토콜에 따라 측정하였다. 혈청 샘플 5 μl에 시약 200 μl를 첨가한 후 37°C에서 5분간 incubate 한 뒤, multi micro-plate reader로 Infinite M200 PRO(TECAN Group Ltd., Männedorf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 ROS 생성량의 측정은 혈청에 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 0분부터 매 10분씩 486 nm emission wavelength와 530 nm excitation wavelength를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다.

6) ROS 생성량 측정

ROS 생성량의 측정은 간 조직을 1 mM EDTA-50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 이용하여 분쇄한 후 25 mM DCFH-DA를 혼합하고, 0분부터 매 10분씩 486 nm emission wavelength와 530 nm excitation wavelength를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다.

7) Cytosol extract

간 조직을 100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 20 mM β-glycerophosphate, 20 mM NaF, 2 M Na3VO4, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 μM pepstatin and 80 mg/L trypsin inhibitor가 포함된 homogenate buffer [10 mM HEPES(pH 7.8), 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 0.1 mM PMSF]와 함께 얼음으로 차갑게 하여 tissue grinder(Bio Spec Product, USA)로 분쇄하였 다. 미토콘드리아 침전물을 얻기 위해 4°C에서 12,000 rpm 으로 15분간 원심분리하였다.

8) Nuclear extract

간 조직을 500 μl hypotonic buffer A [10 mM HEPES (pH 7.8), 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 0.1 mM PMSF]에 넣어 차가운 상태에서 tissue grinder(Bio Spec Product, USA)로 분쇄하였다. 10% NP-40 용액 62.5 μl를 첨가하여 12,00 rpm으로 30초간 원 심분리하였다. 이렇게 얻어진 pelleted nuclei를 10% NP-40 가 더해진 buffer A에 한번 헹구어 12,000 rpm으로 원심분 리하고 100 μl의 buffer C(50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF and 10 % glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 핵단백질을 포함한 상층 액은 수집되어 –80°C에서 냉동 보관하였다.

9) Western blot analysis

SOD, catalase, Gpx, Nrf-2, NF-κB 단백질의 발현을 측정하기 위해 nuclear extract 10 ㎍의 단백질을 10 % SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 5 % skim milk를 함유한 TBS-T(0.5 % Tween 20 in TBS)에 담 그고 1시간동안 blocking 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척 하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(TBS-T로 1: 5,000으로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 간 반응시켰다.
또한 SOD, catalase, Gpx, HO-1, COX-2, iNOS, Bax, cytochrome c 및 β-actin 단백질의 발현을 측정하기 위해 cytosol extract 10 ㎍의 단백질을 8~15 % SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 5 % skim milk 를 함유한 TBS-T(0.5 % Tween 20 in TBS)에 담그고 1시간 동안 blocking 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하고, 각 각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(TBS-T로 1: 5,000으로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 간 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence(ECL) Western Blotting detection reagents(GE Healthcare, Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Davinch-Chemi CAS-400SM Western Imaging System(Davinch-K, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질의 발현 정도를 분석하였다.

10) 통계처리

실험결과는 평균과 표준편차(mean ± SD)로 표기하였으 며, SPSS 18.0 for Windows program을 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA)로 유의수준 p-value < 0.05 에서 검정하였다.

결 과

1. 체중과 간 무게에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 체중이 유의하게 감소하였으나, 태충혈군과 신수혈군은 대조군에 비해 유의한 체중 변화는 없었다.
대조군의 간 무게와 체중 100 g 당 무게로 환산한 간 index값은 정상군에 비해 유의하게 감소하였으나 신수혈군 은 대조군에 비해 유의하게 증가하였고, 꼬리침군은 대조군 에 비해 체중과 간 무게, 간 index값에서 모두 유의한 변화는 없었다(Table 1).

2. 간 기능에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 ALT 수치가 유의하게 증가하였 으나, 신수혈군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. AST 수치는 모든 군에서 유의한 변화가 없었고, 꼬리침군은 대 조군에 비해 모든 검사 수치에서 유의한 변화가 없었다 (Table 2).

3. 산화적 스트레스 억제 효과

혈청의 ROS 생성량은 대조군이 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 태충혈군과 신수혈군은 대조군에 비해 유의하 게 감소하였다. 신수혈군은 대조군에 비해 간 조직의 ROS 생 성량도 유의하게 감소하였고, 꼬리침군은 대조군에 비해 혈 청과 간 ROS 생성량에 모두 유의한 변화는 없었다(Table 3).

4. 간 조직에서 항산화 효소 관련 단백질의 발현에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 SOD와 Gpx 발현량이 유의하게 감소하였다. 대조군에 비해 태충혈군은 catalase 발현량이 유의하게 증가하였으며, 신수혈군은 Gpx 발현량이 유의하게 증가하였다. 꼬리침군은 대조군에 비해 SOD, catalase 및 Gpx 발현량에 모두 유의한 변화는 없었다(Fig. 1).

5. 간 조직에서 항산화 유전자 관련 단백질의 발현에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 Nrf-2와 HO-1 발현량이 모두 유 의하게 감소하였으나, 신수혈군은 대조군에 비해 HO-1 발현 량이 유의하게 증가하였다. 태충혈군과 꼬리침군은 대조군에 비해 Nrf-2와 HO-1 발현량에 유의한 변화는 없었다(Fig. 2).

6. 간 조직에서 염증 관련 단백질의 발현에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 NF-κB, COX-2 및 iNOS 발현 량이 모두 유의하게 증가하였다. 신수혈군은 대조군에 비해 NF-κB, COX-2 및 iNOS 발현량이 유의하게 감소하였고, 태충혈군과 꼬리침군은 대조군에 비해 NF-κB, COX-2 및 iNOS 발현량이 감소하는 경향성을 나타냈으나 유의성은 없 었다(Fig. 3).

7. 간 조직에서 세포사멸 관련 단백질의 발현에 미치는 영향

대조군은 정상군에 비해 Bax와 cytochrome c 발현량이 유의하게 증가하였다. 태충혈군과 신수혈군은 대조군에 비해 Bax와 cytochrome c 발현량이 감소하는 경향성을 나타냈으 나 유의성은 없었고, 꼬리침군도 대조군에 비해 유의한 변화는 없었다(Fig. 4.).

8. 간 조직에서 항산화, 항염증, 세포 보호 효과에 대한 종합적인 영향

태충혈과 신수혈이 산화적 스트레스를 억제시킬 수 있는 항산화 효소 및 유전자 관련 단백질, 염증 관련 단백질, 세 포사멸 관련 단백질 등의 발현에 미치는 영향을 정리하면 Fig. 5와 같다.

고 찰

산업의 발달로 카드뮴, 수은, 납 등의 중금속 오염이 급증 하고, 이로 인한 공해병이 날로 심각해져 국내외적으로 큰 사 회적 문제가 되고 있다. 그 중에서도 카드뮴은 공업적으로 전 기도금, 배터리, 합금, 연료 등의 생산에 이용되어 왔고, 이 러한 공업적인 이용의 증가로 인해 토양, 공기, 물이 오염되 고, 인산 비료와 하수, 카드뮴 함유 살균제의 이용 등을 통해 상당량이 토양에 축적되고 있다1).
카드뮴은 1817년 Strohmeyer에 의해 처음으로 분리되었 으며 인체에 미치는 영향은 1932년 Prodan이 처음으로 기 술하였다28). 카드뮴의 대표적 표적 장기는 간과 신장으로서 이들 기관에 나타나는 증상은 노출되는 양과 형태, 노출시 간 및 체내 침투 경로에 따라 다양한 독성이 나타나게 된다. 카드뮴의 인체중독 현상으로는 간, 위장, 중추신경 장애 등 의 급성중독 증상과 신장 기능 장애, 칼슘 흡수 장애, 골 장 애를 일으키는 이따이이따이 질환과 같은 만성 중독 증상 이 있다29-39).
간 조직은 체내에서 카드뮴이 50~80 %가 축적되어 카드 뮴 중독에 가장 큰 영향을 받는 기관이면서 동시에 해독 기관 이다. 중독 초기에는 간 조직에서의 카드뮴 함량이 높아 조직 손상을 일으키고, 말기에는 신장에 더 많이 축적되어 신장 기 능 부전 및 조직 손상 등을 일으킨다31).
카드뮴의 생체 내 해독 기전의 하나로 합성되는 cadmium-metallothionein(이하 Cd-MT)는 간이나 신장 등에 서 합성된다. 간에서 합성된 무독성의 Cd-MT는 그대로 머 물러 있지 않고 혈액으로 방출되어 나오며, 혈액 중의 Cd-MT는 다른 기관이나 조직의 세포막은 투과하지 못하나 신장의 사구체 막을 선택적으로 투과하기 때문에 빠르게 신 장으로 이행된 후 서서히 오줌으로 배출된다32).
대부분의 중금속은 수산화라디칼(hydroxyl radical, OH) 이나 초과산화이온(superoxide, O2−) 및 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 ROS를 생성하며, 이에 따라 과 산화지방질(lipid peroxide)이 증가하고 DNA가 손상되어 다 양한 세포와 조직 등에서 세포사멸 및 독성을 초래하게 된다. 카드뮴에 의해 생성되는 ROS도 세포 내 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 일으킨다33).
인체는 카드뮴 중독이 일으키는 산화적 스트레스에 대해 생체 방어기구를 갖추고 있으며, 이는 효소성 항산화 방어 기전과 비효소성 항산화 방어기전의 두 가지 형태로 구분된 다34). 이 중 효소성 방어기전은 SOD, catalase, Gpx 등이 있는데, SOD는 초과산화이온을 과산화수소로 전환시키고, catalase는 과산화수소를 물과 산소로 분해하여 제거하는 역 할을 하며, Gpx는 glutathione과 과산화수소를 반응시켜 항 산화 작용을 한다.
비효소성 방어기전은 전사인자 Nrf-2와 센서인자 Kelchlike ECH-associated protein 1(Keap1)로 구성된 것으로, Nrf-2는 세포 내 산화적 스트레스 환경에서 항산화 작용을 전사하는 핵 인자이며, 스트레스에 응답하여 안정화하고 활 성화되는데, 이 Nrf-2의 활성화가 hemo catabolism의 속도 결정 단계에 작용하는 효소인 HO-1을 활성화하여 세포 보호 효과를 나타낸다35).
산화적 스트레스에 의한 세포 내 반응은 cytokine, 성장 인자나 호르몬의 작용과 분비의 조절, 이온 수송의 영향, 전 사의 변화, 세포사멸로 나누어지며 다양한 유전자의 세포 내 신호전달 체계(signal transduction pathway)에 영향을 주 는데, 분자수준에서의 정확한 기전은 알려져 있지 않으나 그 중 가장 많이 연구되고 있는 신호전달 체계는 MAPK 체계와 NF-κB 신호전달 체계를 들 수 있다36). 그 중 NF-κB 신호 전달체계의 활성은 염증 반응에 관여하는 COX-2와 신경세 포의 산화적 손상을 유발하는 nitric oxide 등을 생성하는 iNOS의 발현과 관련되어 있어, NF-κB의 활성이 증가되면 COX-2와 iNOS가 활성화되어 염증반응을 증가시킴으로써 세포사멸을 유발한다37).
또 다른 세포사멸의 과정은 세포 성장을 방해하는 Bax의 구조적 변화로 인하여 미토콘드리아가 손상을 받아 막 전압 이 감소되며, 이후 세포사멸을 매개하는 다양한 단백질들이 미토콘드리아로부터 세포질로 유출되는 과정을 촉진하게 된 다. 그 중 대표적인 것이 cytochrome c인데, 이는 다양한 하 위 caspase를 활성화시켜 궁극적으로 세포사멸을 매개하게 된다38).
중금속 중독에 사용되는 킬레이션 치료는 유기체가 금속 이온과 결합하여 이를 제거하는 것으로 간과 신장에서 카드 뮴의 잔류량을 최소화시키는 효과가 있으나 장기 손상의 우 려가 있다39). 그러므로 마약과 알코올 중독의 침치료에 대한 연구19-21)를 초석으로 삼아 각종 약재와 식품들을 이용한 해 독 치료11-16), 또는 약침을 사용하여 간과 신장 손상을 억제 하는 치료17,18)보다 부작용이 적고 안전하며, 조작이 간편한 침치료에 대한 연구가 필요하다.
카드뮴의 표적 장기인 간의 보호를 위해 고려한 자침 혈위 는 태충혈과 신수혈이다. 태충혈은 足厥陰肝經의 原穴 및 兪穴 로서 생식기, 소화기, 신경계, 혈관계 질환 등을 치료하며40), 특히, 간 손상을 억제하고 조직 세포의 사멸을 보호하며 신경 손상도 보호한다고 알려져 있다41,42). 신수혈은 足少陰腎經의 背兪穴로서 생식기, 비뇨기, 호흡기, 순환기, 신경계, 부인과, 대사 질환 등을 치료하며40), 특히, 신장 기능을 촉진시키고 모르핀을 해독하는 연구에 사용되었으므로26,27), 신장의 배 설기능이 향상되면 水生木의 상생원리에 의해 간의 중독 증 상도 완화시킬 수 있을 것이라는 가정 아래 본 연구를 진행하 였다.
기존의 카드뮴 연구에서는 공통적으로 대조군이 정상군에 비해 체중 증가량의 감소를 보이는데43), 본 연구에서도 대조 군이 정상군에 비해 체중 증가량이 낮았으나 침 자극으로 인 한 변화는 없었다. 간의 무게는 대조군이 정상군에 비해 유의 하게 감소하였는데, 이는 카드뮴 중독에 의해 조직이 손상되 어 나타나는 것이지만, 체중이 감소함에 따라 기관의 무게도 감소할 수 있으므로, 기관의 무게를 체중으로 나눈 값인 간의 index값도 함께 비교하였다. 신수혈군은 간의 무게 및 index 값이 대조군에 비해 모두 유의하게 증가되었으며, 태충혈군 은 대조군에 비해 유의한 변화는 없었다.
각 기관의 기능 검사에서 신수혈군은 대조군에 비해 ALT 수치를 유의하게 감소시켜 간 기능의 회복에 효과가 있다고 사료된다. 카드뮴으로 유발된 산화적 스트레스에 대해 태충 혈과 신수혈이 미치는 영향을 확인하기 위하여 혈청과 간 조 직에서의 ROS를 측정하였는데, 혈청에서 대조군이 정상군에 비해 ROS 생성량이 유의하게 증가하여 카드뮴 중독으로 인 한 산화적 스트레스가 있음을 확인하였다. 또한 태충혈군과 신수혈군 모두에서 혈청의 ROS 생성량이 대조군에 비해 유 의하게 감소하였고, 특히 신수혈군은 간 조직의 ROS 생성량 도 대조군에 비해 유의하게 감소하여 태충혈과 신수혈이 산 화적 스트레스를 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
항산화 효소 및 유전자 관련 단백질에 대하여 태충혈군은 대조군에 비해 catalase 발현량만 유의하게 증가하였고, 신수 혈군은 대조군에 비해 Gpx와 HO-1 발현량이 유의하게 증가 하여 간 조직 ROS를 감소시킨 것으로 보인다(Fig. 1, 2). 염 증 관련 단백질에 대하여 태충혈군은 대조군에 비해 유의한 변화가 없었으나, 신수혈군은 대조군에 비해 NF-κB, COX-2 및 iNOS 발현량이 유의하게 감소하여 항염증 효과를 나타내었다(Fig. 3). 세포사멸 관련 단백질에 대하여 태충혈 군과 신수혈군은 대조군에 비해 Bax와 cytochrome c 발현량 이 감소하는 경향성을 나타냈으나 유의성은 없었다(Fig. 4).
간 조직에서 태충혈과 신수혈이 산화적 스트레스를 억제 시킬 수 있는 항산화 효소 및 유전자 관련 단백질, 염증 관련 단백질, 세포사멸 관련 단백질 등의 발현에 미치는 영향을 정 리하면 다음과 같다(Fig. 5).
카드뮴으로 유발된 간의 산화적 스트레스에 대하여 신수혈 은 태충혈에 비해 항산화, 항염증, 세포사멸 보호 등 모든 기 전에서 뛰어난 효과를 나타냈으며, 이는 신수혈이 간과 신장 으로 연계되는 인체의 해독 시스템에서 신장의 역할을 증대시 킴으로써 간의 기능을 도와준 것으로 사료된다. 태충혈과 신 수혈의 침 자극은 부작용이 없는 안전한 치료로서 카드뮴으로 손상된 간을 보호하는데 효과가 있으며, 중금속 해독의 약물 치료와 병행하여 시너지 효과를 기대할 수 있을 것이다.
다만, 혈액산소수준의존(blood-oxygen-level dependent, BOLD) 뇌기능자기공명영상(functional magnetic resonance imaging, fMRI)을 이용한 국소 마취 전후의 침 자극으 로 유발된 뇌 반응 연구44)에서 마취 전 침 자극은 통증 전달 경로 및 의미, 인식, 실행 기능의 영역 등 통증과 관련된 경 로를 활성화시켰고, 마취 후 침 자극은 감각, 운동, 의미, 공 간 지각 기능 등 통증과 무관한 경로를 활성화시켰다. 이는 마취 전후의 침 자극이 주로 통증과 관련된 신경기능 경로에 서 차이를 보이는 것으로, 마취의 유무는 침 자극 시 통증의 유무에 영향을 끼칠 뿐 침 자극으로 인한 기능적 효과와는 무 관한 것으로 볼 수 있다. 따라서 각 군에서의 마취 시행 유무 는 본 연구의 결과에 영향을 미치지 않을 것으로 판단되나, 뇌 영역에서의 경로 이외에 장기 영역에서의 침 자극 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결 론

카드뮴으로 유발된 산화적 스트레스에 대한 태충혈과 신 수혈 침 자극의 간 보호 효과에 대해 다음과 같은 결과를 얻 었다.
  1. 체중은 대조군이 정상군에 비해 유의하게 감소하였으 나 태충혈군과 신수혈군은 대조군에 비해 유의한 변화 가 없었다. 간의 무게는 대조군이 정상군에 비해 유의 하게 감소하였고, 신수혈군만 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 간 무게를 체중으로 나눈 index값에서 대 조군의 간 index값은 정상군에 비해 유의하게 감소하 였고, 신수혈군은 대조군에 비해 간 index값이 유의하 게 증가하였다.

  2. ALT는 대조군이 정상군에 비해 유의하게 증가하였으 나 AST는 모든 군에서 유의한 변화가 없었다. 대조군 에 비해 신수혈군은 ALT가 유의하게 증가하였다.

  3. 대조군 혈청의 ROS는 정상군에 비해 유의하게 증가하 였고, 간 조직의 ROS는 정상군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다. 대조군에 비해 태충혈군은 혈청의 ROS가 유의하게 감소하였고, 신수혈군은 혈청과 간 조직의 ROS가 모두 유의하게 감소하였다.

  4. 간 조직에서 태충혈군은 대조군에 비해 catalase 발현 량만 유의하게 증가하였고, NF-κB, COX-2, iNOS, Bax 및 cytochrome c 발현량은 유의한 변화가 없었 다. 신수혈군은 대조군에 비해 Gpx와 HO-1 발현량이 유의하게 증가하여 항산화 효과를 나타내었고, NF-κB, COX-2 및 iNOS 발현량이 유의하게 감소하여 항염증 효과를 나타내었으나, Bax와 cytochrome c 발현량은 감소하는 경향은 있었으나 유의성이 없어 세포 사멸에 대한 유의한 보호 효과는 나타나지 않았다.

  5. 카드뮴으로 유발된 간의 산화적 스트레스에 대한 태충 혈 침 자극은 유의한 항산화 효과를 나타내었고, 신수 혈 침 자극은 유의한 항산화, 항염증 효과를 나타내었 으나 세포사멸에 대한 보호 효과는 유의성이 없었으 며, 전반적으로 신수혈이 태충혈보다 간의 보호 작용 에 더 유의한 효과를 나타내었다.

Fig. 1.
Hepatic antioxidant enzyme-related protein expressions
(A) superoxide dismutase(SOD). (B) catalase. (C) glutathione peroxidase(Gpx).
*: ρ < 0.05, **: ρ < 0.01 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.
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Fig. 2.
Hepatic antioxidant gene-related protein expressions
(A) nuclear factor erythroid derived 2-related factor 2(Nrf-2).
(B) heme oxygenase-1(HO-1).
*: ρ < 0.05, **: ρ < 0.01 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.
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Fig. 3.
Hepatic inflammation-related protein expressions
(A) nuclear factor-κB(NF-κB). (B) cyclooxygenase-2(COX-2). (C) inducible nitric oxide synthase(iNOS).
*: ρ < 0.05, **: ρ < 0.01, ***: ρ < 0.001 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.
acupunct-31-4-33f3.gif
Fig. 4.
Hepatic apoptosis-related protein expressions
(A) Bax . (B) cytochrome c.
*: ρ < 0.05 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.
acupunct-31-4-33f4.gif
Fig. 5.
Predictable mechanisms in hepatic tissues applied acupuncture
acupunct-31-4-33f5.gif
Table 1.
Body Weight Gain and Liver Weight
Item Normal Cadmium 2 mg/kg
Control LR3 BL23 Sham
Body weight gain(g / 3 weeks) 89.8 ± 4.2c 81 ± 7.0 74.6 ± 12.9 77.6 ± 9.6 79.8 ± 10.5
Tissue weight(g) 11.78 ± 0.54c 7.54 ± 0.24 8.10 ± 0.30 13.11 ± 0.96a 7.56 ± 0.30
% of tissue weight(g / 100 g BW) 4.77 ± 0.18c 3.11 ± 3.08 3.33 ± 0.09 6.40 ± 0.63b 3.06 ± 0.09

a ρ < 0.05

b ρ < 0.01

c ρ < 0.001 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.

Table 2.
Parameters of Hepatic Functions
Item Normal Cadmium 2 mg/kg
Control LR3 BL23 Sham
ALT(IU/L) 58.2 ± 0.8b 63.9 ± 0.3 61.8 ± 0.8 56.0 ± 0.2a 63.2 ± 0.7
AST(IU/L) 78.4 ± 0.8 79.4 ± 0.5 79.7 ± 0.7 72.2 ± 2.3 79.4 ± 0.6

a ρ < 0.05

b ρ < 0.001 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.

Table 3.
ROS Generation in the Serum and Liver
Item Normal Cadmium 2 mg/kg
Control LR3 BL23 Sham
Serum ROS(flu/min/ml) 61 ± 3b 145 ± 17 62 ± 5b 34 ± 2c 145 ± 21
Hepatic ROS(flu./min/mg protein) 308 ± 14 319 ± 14 312 ± 50 233 ± 21b 294 ± 71

b ρ < 0.01

c ρ < 0.001 compared to cadmium-treated control group by ANOVA.

VI.
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