통증이란 사람이 느끼는 불쾌한 감각을 말하며, 우리 인체 어느 부분에 이상이 생겼음을 알려주는 신호 중 하나이다[1]. 국제통증연구학회(IASP)에 의한 통증 혹은 고통의 정의는 실제적·잠재적인 조직 손상 또는 피해 등과 관련된 불편한 감각적·감정적 경험을 말한다[2]. 통증은 임상적으로 다양한 형태로 나타나는 특징이 있으며[3], 기계적 자극, 화학적 자극 및 온도와 관련된 자극이 단독 또는 복합적으로 작용하여 증상이 시작된다[4]. 자극으로 인해 인체에서 생성 혹은 활성화된 Substance P, Prostaglandin, Bradykinin, Serotonin, Histamine, Acetylcholine, K⁺ 및 Acid 등이 통증과 관련된 화학물질로 알려져 있다[5]. 치료 방법으로는 진통제 등의 약물 요법과 신경차단술 혹은 외과적인 수술을 시행하기도 한다[6].

한의학에서는 통증을 經脈氣血의 流行不暢 혹은 氣血凝滯 등에 의해 발생하는 증상으로 판단하고[7], 침구, 한약, 추나 및 약침요법 등을 치료법으로 활용하고 있다. 이 중 약침요법은 자침 자체의 효과와 더불어 약물이 가진 효능을 결합시켜 질환을 치료하는 방법으로[8] 적응증이 광범위하고 치료효과가 빠르며 약을 복용하기 힘든 환자에게 유용하고 시술방법이 간단하여 임상에서 많이 활용되고 있다[9]. 최근 통증과 관련된 약침 연구를 살펴보면, 지 등[10], 이 등[11], 배 등[12], 김 등[13], 지 등[14]의 보고에서 알 수 있듯이 통증이라는 증상 자체보다는 통증의 원인 질환치료에 중점을 두고 있음을 알 수 있다.

주목(朱木, Taxus cuspidata, TC)은 利尿와 通經의 효능이 있어 소변불리와 당뇨병에 쓰였으며[15], 주목의 약침제제는 潤劑 중 氣劑라 하여 통증의 원인이 되는 氣血不暢을 해소함으로써 수근관 증후군, 추간판 탈출증 및 건염 등의 질환에 활용되고 있다[16]. 그러나 실제 임상에서는 봉약침이나 다른 약침에 비해 활용빈도가 떨어지고, 연구보고 또한 상대적으로 부족한 실정이다. 비록 최근 연구에서 이 등[17]의 중풍 후 중추성 통증에 주목약침을 사용한 증례보고와 김 등[16]의 주목 추출 성분의 항염증, 항산화 활성에 대한 연구가 보고되었으나, 주목의 진통 효과에 대한 구체적인 실험적 연구나 추출 방식에 따른 효능 차이를 비교 연구한 보고는 찾기 힘들다. 또한 주목의 주요 성분물질인 taxol은 항암치료에 효과가 있어 널리 쓰이고 있으나, 말초신경병증 등의 부작용이 밝혀져[18], 최근에는 암 환자의 치료와 관련하여 그 부작용을 조절하는 방법에 관한 연구가 대부분이고 암성 통증에 대한 연구는 부족하다.

이에 저자는 주목의 진통 효과를 검증하고 임상에서의 활용도를 높이는 방안을 모색하기 위해 연구를 시행하였다. Rat의 태계(KI03)에 서로 다른 추출 방식의 주목약침(Taxus cuspidata pharmacopuncture, TCP)을 주입하고 formalin으로 통증을 유발시킨 후, USV 분석과 혈액 및 혈청학적 변화 등을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

1. 재료

1) 실험용 동물

본 연구의 실험동물은 ㈜효창사이언스(대구, 대한민국)에서 구매한 총 30마리의 체중 200~250 g인 7주령 수컷 SD-rat이었다. lab-chow 식이[㈜제일사료, 경기도, 대한민국]로 1주 동안 안정화시킨 후 사용하였다. 사육 기간 동안 온도 24 ℃, 상대습도 55 %를 유지시키고 오전 8시에서 오후 8시까지 12시간 명암주기를 유지하여 3마리씩 케이지에서 사육하였으며, 1주간의 적응기간 후 randomized block design에 의해 각각의 군으로 나누어 실험하였다. 실험 진행 시 rat의 스트레스를 최소화시키기 위하여 각각 방음케이지에 넣어 최소 40분 이상의 적응시간을 가진 후 Avisoft RECORDER program(Avisoft bioacoustics, Germany)을 사용하여 base line을 20분간 측정하여 안정화를 확인하였다.

본 연구는 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 진행되었다(승인번호 : DHU2015-065).

2) 실험용 약재

㈜토종마을(서울, 대한민국)에서 구입한 건조된 주목(충청북도, 대한민국)의 수피 및 가지와 잎을 물로 세척한 후 사용하였다.

2. 연구 방법

1) 약침의 제조 및 추출 방식

추출 방식으로 열수 추출법, 에탄올 추출법 및 초음파 추출법을 선택하였다. 열수 추출법의 경우, 주목을 부직포에 싸고 원료 중량의 15배에 해당하는 100 % 물을 용매로 사용하여 100 ℃ 상승 후 3시간 동안 추출하였다. 에탄올 추출법의 경우, 주목을 부직포에 싸고 원료 중량의 15배에 해당하는 80 % 에탄올을 용매로 사용하여, 실온에서 72시간 동안 침지하여 추출하였다. 열수 및 에탄올 추출법으로 추출한 용액은 모두 부크너 깔때기(Single Piece, 1000 mL, 제이오텍, 대전, 대한민국)에 와트만 여과지(No. 2)(GE Healthecare, USA)를 깔고 감압여과 후 농축기(COS-MOS660, 경서 E&P, 인천, 대한민국)에서 1차 농축을 실시하였고, 약 5~10 brix 정도의 1차 농축액은 7,000 rpm에서 20분 동안 원심분리기(Hanil Continent-R, 한일과학산업, 인천, 대한민국)로 원심분리하여 2차 여과한 후 동결건조기(Pilot, 일신바이오베이스, 경기도, 대한민국)에서 건조하여 시료를 획득하였다. 초음파 추출법의 경우, 열수 추출한 동결건조물에 70 % 에탄올을 원료의 10배가 되도록 용매로 사용하여 초음파추출기(NXCS-1200, 고도기연, 경기도, 대한민국)로 2시간 동안 추출하였고, 45~50 ℃ 수욕상에서 4시간 동안 감압 농축시킨 후 –84 ℃, 압력 0.12 mbar로 동결건조시켰다. 이에 추출물의 수득률은 열수 추출법이 8.5 %, 에탄올 추출법이 7.15 %, 초음파 추출법이 6.53 %였다(Table 1).

추출된 모든 시료들을 normal saline에 용해한 후 NaOH를 사용하여 pH를 6.8~7.0으로 조정하였으며, 제조한 모든 약침액의 농도를 5 %로 동일하게 하였다. Ministart syringe filter(0.2 um, Sartorius, Germany)로 필터 후 insulin syringe(0.3 mL, 31 gauge, BD Medical, France)를 사용하여 다음의 연구 방법 중 각 군별 처치에 따라 처치하였다.

2) 군 설정

주목약침의 진통 효과와 함께 추출 방식에 따른 효능 차이를 비교하기 위해 정상군(NOR)과 대조군(CON), 주목의 열수 추출군(W), 에탄올 추출군(E) 및 초음파 추출군(U) 등 총 5개의 군으로 분류하였으며, 각 군마다 6마리의 rat으로 구성하였다.

3) 치료군의 분류 및 처리

각 군별로 두 차례에 걸쳐 처치를 시행하였고 내용은 다음과 같았다(Fig. 1).

• (1) 정상군(NOR) : Normal saline 처치 35분 후 normal saline 처치

• (2) 대조군(CON) : Normal saline 처치 35분 후 formalin 처치

• (3) 열수 추출군(W) : 열수 추출 약침 처치 35분 후 formalin 처치

• (4) 에탄올 추출군(E) : 에탄올 추출 약침 처치 35분 후 formalin 처치

• (5) 초음파 추출군(U) : 초음파 추출 약침 처치 35분 후 formalin 처치

첫 번째 처치에서 각각의 normal saline과 주목약침은 모두 rat의 우측 KI03에 피부로부터 3~4 ㎜ 깊이로 40 uL 용량을 처치하였고, rat의 KI03 위치는 골도분촌에 의해 인체에 상응하는 부위인 뒷발 경비골 내과의 후방 함요처를 취하였다[19]. 두 번째 처치에서 각각의 normal saline과 formalin은 모두 rat의 우측 뒷발에 2 ㎜ 깊이로 40 uL 용량을 처치하였다. 두 차례의 처치에서 물질의 주입은 모두 동일한 제품의 insulin syringe로 진행했다.

두 번째 처치에 해당하는 formalin test는 약침 자극에 의한 통증을 배제하기 위하여 첫 번째 처치 후 35분간의 흡수 및 진정 과정을 거친 후 5 % formalin을 처치하여 통증을 유발시켰고, 유도된 통증의 적절성 여부는 정상군과 대조군을 비교하여 확인했다.

4) USV 분석

Avisoft RECORDER program을 이용하여 rat의 안정화를 확인하기 위한 base-line 분석 및 각 군별 처치가 끝난 후의 USV를 측정하였다. 일반적으로 rat이 고통을 느낄 때 내는 파장인 18~30 kHz [20]영역의 녹음된 파장을 잘라 Pulse train Analysis하여 지정된 음역대에서 rat이 발성한 소리의 횟수를 기록하였다.

발성음의 녹음은 40분 동안 진행되었으며, 발성 횟수의 기록은 5분 단위로 진행되었다.

Correa CR 등[21]의 실험을 참고하여 0~5분을 early phase, 5~20분을 inter-phase, 20~40분을 late phase로 나누어 설정하였다.

5) 혈액 채취

USV 분석 종료 후 rat에 isoflurane 흡입마취를 진행 후 개복하여 복부 하대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 EDTA 처리 후 4 ℃에서 15분간 원심분리한 후 혈장을 수집하여 시료 분석 실시 전까지 –80 ℃에 보관하였다.

6) Substance P 활성도 측정

Substance P의 활성도는 혈장 substance P의 농도 측정을 통해 분석하였다.

혈장 Substance P 농도의 측정은 Substance P와 Substance P AChE의 Substance P 결합 특정 항체로의 경쟁결합원리를 이용한 Substance P EIA Kit(Caymanchem, USA)를 사용하여 분석하였고, Substance P 항체가 부착된 96-well plate에 표본 및 Substance EIA 항혈청을 분주하여 4 ℃에서 1일 동안 보관한 후 5회 세척하여 Ellman's Reagent(5,5' - dithiobis - (2 - nitrobenzoic acid), DTNB)와 상온에서 90분 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7) 간 독성 분석

간 독성 분석에는 간세포의 손상과 관련이 있는 AST와 ALT의 활성도를 측정하였고, 분광 광도계(Sunrise, TECAM, Austria)를 사용하여 Reitman-Frankel의 비색 분석법[22]을 적용하였다. 혈청 AST와 ALT를 각각의 기질액(Asan kit, 서울, 대한민국)에 가하여 일정한 온도(37 ℃)와 시간(AST : 60분, ALT : 30분) 동안 반응시켜 pyruvate로 전환되게 하였고, 여기에 발색 용액을 각각 가 하여 실온에서 반응시켰다. 발색 용액 첨가 20분 후에 0.4 N NaOH 10 mL와 혼합하여 다시 10분 동안 반응시킨 후, 분광 광도계를 통해 490~530 nm에서 흡광도의 측정을 시행하였고, 표준곡선과 비교하여 농도를 환산하였다. 혈장은 각각 200 uL, 기질액과 발색 용액은 각각 1 mL를 사용하였고, 기질액은 모두 혼합 전 37 ℃에서 5분 정도 방치한 후 사용하였다. 혈청 AST에 처치한 기질액은 α-Ketoglutarate, L-aspartate이고, 혈청 ALT에 처치한 기질액은 α-Ketoglutarate, D,L-alanine이며, 발색용액은 2,4-dinitrophenyl hydrazine을 사용하였다. 측정에 사용한 표준곡선은 혈청 transaminase 측정용 시약의 매뉴얼을 따랐다.

8) 통계 분석

모든 실험 결과는 mean ± standard error(S.E.)로 표시하였고, IBM SPSS Statistics 22.0 program(Statistical package for the social sciences, SPSS Inc. Chicago)을 통해 산출되었다.

정상군과 대조군 간의 유의성 검정을 위해 Student’s t-test를 실시하였고, 각 군 간의 평균 차이에 대한 유의성 검정은 One-way ANOVA를 실시하였으며, Duncan’s multiple range test에 의해 p ＜ 0.05 이상의 수준에서 사후검정을 실시하였다.

1. USV 분석

Rat은 USV 분석 동안 일반적인 통증 행동의 양상과 유사한 패턴을 보였고, 피부의 이상반응은 관찰되지 않았다.

Rat에 formalin을 처치하여 통증을 유발한 후 18~30 kHz 영역의 USV를 분석 프로그램을 이용하여 측정한 결과, 그 파형 및 수치는 다음과 같았다(Fig. 2).

정상군과 대조군의 early phase(0~5분) 및 late phase (20~40분)에 대한 음파측정 비교 시, USV의 측정값이 early phase에서 대조군은 809.25 ± 35.23 counts/Num로 정상군의 391.00 ± 57.92 counts/Num보다 높았고(p = 0.001), late phase에서 대조군은 275.85 ± 84.89 counts/Num로 정상군의 19.23 ± 2.43 counts/Num보다 높게 측정되었다(p = 0.029). 이를 통해, phase에 상관없이 대조군이 정상군에 비해 모두 유의적으로 높으므로 formalin 처치로 인한 통증이 적절하게 유도되었음을 확인할 수 있었다.

Formalin 처치 후 phase별 효과를 살펴보면, early phase의 경우 열수 추출군에서 400.33 ± 72.19 counts/Num, 에탄올 추출군에서 419.00 ± 73.09 counts/Num, 초음파 추출군에서 515.00 ± 81.00 counts/Num로 모두 대조군의 809.25 ± 35.23 counts/Num보다 유의성있게 낮았으며, 그 수준은 통증을 유발하지 않은 정상군의 391.00 ± 57.92 counts/Num와 유사하였다.

Late phase의 경우, 열수 추출군에서 197.24 ± 29.91 counts/Num, 에탄올 추출군에서 145.58 ± 49.44 counts/Num로 두 군 모두 대조군의 275.85 ± 84.89 counts/Num와 비교하여 낮게 측정되었고, 초음파 추출군에서 334.10 ± 10.78 counts/Num로 대조군에 비해 높게 측정되었으나 열수 추출군, 에탄올 추출군 및 초음파 추출군 모두 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이는 없었다. 다만, 에탄올 추출군을 초음파 추출군과 비교했을 때 USV 차이는 유의성이 있었다(p ＜ 0.05)(Fig. 3).

2. 혈장 Substance P 활성도 측정

정상군과 대조군의 혈장 Substance P의 농도를 비교했을 때 정상군에서 10.98 ± 0.64 pg/mL, 대조군에서 13.31 ± 0.74 pg/mL로 정상군에 비해 대조군의 Substance P의 농도가 유의성 있게 높은 것을 알 수 있었다(p = 0.038).

열수 추출군과 에탄올 추출군의 Substance P 농도는 각각 11.31 ± 0.73 pg/mL, 11.54 ± 0.42 pg/mL로 대조군과 비교하여 두 군 모두 농도가 낮았으나 열수 추출군에서만 유의성 있게 낮은 것을 알 수 있었다. 초음파 추출군의 Substance P 농도는 13.59 ± 0.54 pg/mL로 대조군에 비해 높게 측정되었으나 유의성 있는 차이는 없었다. 다만, 열수 추출군 혹은 에탄올 추출군을 초음파 추출군과 비교했을 때 Subtance P의 농도 차이는 유의성이 있었다(p＜0.05)(Fig. 4).

3. AST 및 ALT 활성도 측정

AST는 정상군은 36.70 ± 1.59 karmen/mL, 대조군은 34.22 ± 4.79 karmen/mL로 측정되었고, 주목약침을 처치한 실험군에서 열수 추출군은 34.68 ± 3.48 karmen/ mL, 에탄올 추출군은 30.63 ± 1.49 karmen/mL, 초음파 추출군은 33.78 ± 3.38 karmen/mL로 측정되어 유의한 차이가 없었다.

ALT는 정상군은 18.82 ± 0.23 karmen/mL, 대조군은 17.35 ± 0.62 karmen/mL로 측정되었고, 주목약침을 처치한 실험군에서 열수 추출군은 17.68 ± 2.17 karmen/ mL, 에탄올 추출군은 19.00 ± 0.54 karmen/mL, 초음파 추출군은 18.77 ± 0.52 karmen/mL로 측정되어 유의한 차이가 없었다(Fig. 5).

의료 기술의 발전과 평균 수명의 연장으로 각종 질환이나 수술 후에 발생하는 통증 관리에 대한 대중적 관심도가 높아지고 있다. 전 인구의 약 20 % 정도가 통증을 가지고 있고 이 중에서도 약 35 %는 통증으로 인해 일상생활의 불편을 경험하고 있는데[23], 이는 개인의 삶과 함께 사회·경제적으로도 중요한 의미를 가진다. 이러한 문제를 해결하기 위해 의료 분야를 포함한 각종 영역에서 통증의 관리 혹은 통증의 원인 질환에 대한 치료 방법에 관하여 다양한 연구가 활발하게 진행되고 있다[24].

통증은 대다수의 질환에서 동반되어 나타나는 증상으로 몸의 이상을 알리는 경고신호이자 신체를 보호하기 위한 방어기전이다. 이러한 통증의 긍정적인 역할에도 불구하고 불필요하게 신체에 계속해서 남아 있게 되면 그 자체가 직접적인 고통을 주고 삶의 질을 저하시킨다[5]. 결국 통증은 신체를 보호하기 위해 꼭 필요하지만 역할을 다한 후 그 원인을 찾아 반드시 제거되어야 하는 것이다[1]. 한의학에서도 ‘十病九痛’이라 하여 통증과 질병이 밀접한 관계가 있음을 강조하고 질병의 진단과 처치에 있어서 통증에 대한 치료를 강조하였음을 알 수 있다[25].

통증은 기간 혹은 원인에 따라 분류할 수 있고, 이에 따라 치료법도 다양하게 존재한다. 통증의 치료를 위해서 크게 비수술적 방법과 수술적 방법이 시행되고 있는데, 비수술적 방법으로는 약물치료, 물리치료, 전기치료, 레이저치료 및 신경차단술 등을 활용하고 있고[23], 이 중 약물치료는 비스테로이드 항염증제, 항우울제, 항경련제, 아편유사 진통제 및 도포 약물 등이 주로 사용되는 약물이다[26]. 증상의 정도가 극심하거나 통증의 원인 병소 제거가 필요한 경우 외과적인 수술요법을 시행하고 있다[6].

한의학에서 통증은 원인이나 형상에 따라 분류되었고, ‘不通則痛 不營則痛’의 두 가지 병리로 설명하고 있다. 기본적으로 氣血의 순환장애를 증상 발생의 원인으로 보며, 구체적으로 寒, 熱, 七情, 痰飮, 瘀血, 飮食 및 勞倦 등에 의해서 발생하는 것으로 여긴다[25]. 치료는 병인 제거를 위주로 하되 증상의 완화를 부수적으로 겸하며, 원인에 따라 적절하게 치료법을 선택하여 氣血暢達과 陰陽調和하는 것을 최종 목표로 한다. 치료 방법에는 침구치료, 한약치료, 약침치료 및 추나치료 등이 있으며, 최근에는 침구치료와 한약치료의 장점을 결합한 약침요법에 대한 관심도가 높아져 이에 대한 연구 및 임상활용이 많아지고 있다[9].

약침요법은 침치료를 통한 경혈자극을 제공할 뿐만 아니라 적절한 효능의 약물 투여를 통해 치료 효과를 높일 수 있는 대표적인 신침요법이라고 할 수 있다[8]. 약침액의 종류에 따라 활용할 수 있는 적응증이 다양하기 때문에 약침치료에 이용 가능한 약물 연구가 활발히 진행 중이며, 특히 시간과 비용 대비 생산이 용이하고 타 약물에 비해 효과가 탁월한 약물 추출물을 찾기 위한 노력을 하고 있다. 같은 약물의 경우에도 추출 방식에 따라 유효성분의 수득률과 효과가 달라질 수 있으므로 여러 가지 추출 방식이 개발되고 있으며, 현재 널리 사용하고 있는 방식은 알코올 수침법, 증류 추출법, 저온 추출법, 압착법 및 희석법 등이 있다[9]. 추출 방식은 약재의 성질이나 형태 또는 사용 의도와 생산의 경제성 등을 고려하여 선택하게 된다. 일반적으로 열수추출법과 알코올 수침법이 많이 활용되며, 최근에는 초고압 추출, 막분리 추출 및 마이크로파 추출 등의 방법이 있으나 비용이 많이 들고 추출물의 양이 적다는 단점이 있다[27]. 이에 반해, 초음파 추출은 일반적인 실험실에서도 약물의 추출이 가능하고 추출에 소모되는 시간이 짧으며 수득률은 높다는 장점이 있어 의약 분야뿐만 아니라 여러 산업 분야에서도 응용되고 있다[28]. 약침요법은 특히 근·골격계 질환에 대한 활용빈도가 높은데, 대부분의 근·골격계 질환이 통증을 동반하므로 통증과 관련한 약침요법의 연구가 지속적으로 진행되고 있다[29].

주목(朱木, Taxus cupidata)은 주목과(Taxaceae)에 속하는 상록 침엽수로 우리나라에서 흔히 볼 수 있고, 눈주목(Taxus cuspidata var. caespitosa(Nakai))의 가지와 잎 부분이 약용으로 쓰인다[30]. 자삼(紫衫)이라고도 하며 淡平한 性味로 腎으로 歸經하고, 효능은 利尿通經하여 小便不利와 消渴病 등에 쓰인다[15]. Taxine, Taxinine, Taxane 및 Alkaloids 등이 주요 성분으로 밝혀져 있고[31], 다양한 성분으로 의학 분야 외에도 건강보조식품, 기능성 화장품 등으로 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 주목 추출물 성분의 항암 효과가 알려지면서 이를 활용한 항암제 개발과 관련한 연구가 활발하게 진행되고 있으나[32], 암 환자 관리에 있어 중요한 통증 조절과 관련한 연구는 많이 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 임상에서의 활용성을 높이기 위해 약침제제로써의 주목의 통증 조절 효과에 대하여 규명하고 추출 방식에 따른 효능의 차이를 알아보고자 실험을 진행하였다.

실험은 정상군과 대조군에는 normal saline을 처치하고 열수 추출군, 에탄올 추출군 및 초음파 추출군에는 각각의 주목약침을 처치하여 35분 후 정상군은 다시 normal saline을 처치하고, 정상군을 제외한 나머지 군은 formalin test를 진행하여 통증을 유발하였다. Formalin test를 시행하기 전, normal saline과 주목약침은 rat의 우측 KI03에 처치하였고, 이후 normal saline과 formalin은 rat의 우측 뒷발에 처치하였다. 결과는 USV 분석과 혈액 및 혈청학적 변화를 측정하여 분석하였다.

태계(太谿, KI03)는 足內踝後 5 分에 위치한 足少陰腎經의 穴로 滋腎陰, 退虛熱, 壯元陽, 理胞宮, 强健腰膝하여 腰痛, 脚痛, 神經衰弱, 下肢癱瘓, 腎炎, 膀胱炎, 齒痛 및 月經不調 등에 활용되며, 兪穴로 體重節痛에 사용한다. 해부학적으로는 경골신경이 지나가는 부위로 발바닥과 연관성이 있다[8]. 이러한 경혈학, 신경생리학적인 근거와 더불어 본 실험에서의 유효성 검정을 위해 실시한 사전 검사에서 족삼리(足三里, ST36)와 KI03에 각각 주목약침을 단회 처치한 후 USV 결과를 비교했을 때 상대적으로 높은 진통효과를 보인 KI03를 실험에 사용할 혈위로 선정하였다.

Formalin test는 실험동물에 화학적 자극을 주어 급성 통증을 유발시킨 후 일정시간이 지나도 통증이 지속될 수 있도록 하는 실험 방법이다. Formalin을 rat에 처치하게 되면 특징적인 통증 행동 양상이 나타나게 되고, 이는 early phase와 late phase로 나누어 볼 수 있다. Early phase는 formalin의 처치 후에 1차 구심성 섬유의 활성도가 증가한 상태이고, late phase는 자극으로 인한 말초조직에서의 염증성 반응 또는 중추 신경계의 변화 등에 의해 early phase에 비해 활성도가 감소된 구심성 섬유에도 불구하고 통증이 오랫동안 지속적으로 나타나는 상태이다[33]. 이와 같이 formalin 처치는 두 가지 형태의 통증 양상을 모두 관찰할 수 있는 통증 모델로써 많은 실험에 응용되고 있으며, 본 실험에서는 유해 자극 전 체내에 주입된 주목약침이 formalin으로 유도될 통증에 대하여 어떤 기전과 수준으로 예방적 진통 효과 혹은 지속적 진통 효과를 가지는지 알아보기 위해 적용되었다.

Rat의 통증 평가를 위해 활용된 USV 분석은 설취류의 발성음이 감정이나 상태 등 다양한 정보를 포함하는 점을 활용한 분석 도구이다. Rat은 특정 상황에 따라 초음파를 발성하는데, 일반적으로 쥐의 초음파 발성은 20~32 kHz의 낮은 초음파 발성음과 35~70 kHz의 높은 초음파 발성음으로 구분된다. 특히, 20~32 kHz의 발성음은 부정적인 감정 혹은 고통과 관련된 발성음인 것으로 알려져 있어서[34], 각종 실험용 쥐를 이용한 실험에서 통증의 정도나 기타 상태의 척도로써 활용되고 있다[35].

본 실험의 USV 분석에서 정상군과 대조군을 비교해보면 early phase 혹은 late phase와 무관하게 대조군이 정상군에 비해 모두 유의적으로 높게 측정되어 formalin 처치로 인한 통증이 적절하게 유도되었음을 알 수 있었다.

USV 분석에서 시간에 따른 차이를 비교해보면 early phase(0~5분)에서는 약물 추출 방식에 상관없이 열수 추출군, 에탄올 추출군 및 초음파 추출군 모두 대조군에 비해 통증 관련 초음파 발성 횟수가 유의하게 적은 것을 알 수 있었다. 또한 열수 추출군, 에탄올 추출군 및 초음파 추출군 각각의 군 간 비교에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 하지만 late phase(20~40분)에서는 열수 추출군과 에탄올 추출군은 대조군에 비해 수치가 낮았고, 초음파 추출군은 대조군에 비해 수치가 높았으나, 결과적으로 열수 추출군, 에탄올 추출군 및 초음파 추출군 모두 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이가 없었다. 이를 통해 주목약침의 진통 효과는 통증 초기에 유효하며 후기에는 유의성이 떨어짐을 알 수 있었고, 초기 진통에서도 주목의 추출 방식에 따른 효능의 차이는 적다고 생각된다. 다만, late phase에서 에탄올 추출군과 초음파 추출군 간의 차이는 유의성이 있으므로 추출 방식에 따라 진통의 지속력과 관련된 약리 성분의 수득 차이가 있을 것으로 생각된다.

Substance P는 말초 혹은 중추신경계 등에 분포하는 11개의 아미노산으로 구성된 신경펩타이드로[36], 말의 뇌와 장에서 혈압과 관련된 인자로 처음 발견되었다[37]. 혈관 이완 기능 외에도 체내에서 여러 가지 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 신경성 염증 및 통증과 관련된 매개체로써의 역할이[38] 밝혀져 이와 관련된 많은 실험에서 활용되고 있다. 통증과 같은 자극이 있을 때 1차 구심로에 의해 통각이 전달되면 c-fiber의 활성을 통해 Substance P와 같은 신경전달물질이 분비되어 통각신호가 뇌로 전달되면서 통증을 느끼게 된다[39]. 이와 같이, Substance P는 1차 구심성 섬유의 활성화에 의해 혈장 내 농도가 증가하므로 농도 측정을 활용한 활성도 분석을 통해 초기 통증에 대한 관찰 지표 중 하나로 활용되고 있다.

본 실험의 혈장 Substance P의 활성도 분석에서 대조군의 농도가 정상군에 비해 유의하게 높은 것을 알 수 있었고, 이는 formalin 통증 모델에서 Substance P의 농도가 증가되는 기전이 작용함을 나타낸다. 혈장 Substance P의 농도는 열수 추출군과 에탄올 추출군에서는 대조군에 비해 감소하였고 초음파 추출군에서는 대조군에 비해 증가하였으나, 유의성은 열수 추출군에서만 나타났으므로 열수 추출법을 통해 추출한 주목약침은 혈장 Substance P의 농도를 효과적으로 감소시켰다고 볼 수 있다. 다만, 열수 추출군 혹은 에탄올 추출군을 초음파 추출군과 비교했을 때 혈장 Substance P의 농도 차이가 유의성이 있으므로 추출 방식에 따라 Substance P와 관련된 약리 성분의 수득 차이가 있을 것으로 생각된다. Substance P 농도의 감소는 초기 통각신호 전달을 억제하여 통증의 정도가 완화되었음을 의미하는데, 열수 추출법으로 추출한 주목약침의 경우가 이와 관련된 과정을 통해 진통 효과가 나타났다고 볼 수 있고, 에탄올 및 초음파 추출법으로 추출한 주목약침의 경우는 Substance P와 관련된 1차 구심로 경로에 대한 영향력은 떨어지는 것으로 보여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

간 독성 여부를 알아보기 위해 AST와 ALT의 활성도를 분석한 결과 주목약침의 추출 방식에 상관없이 군 간 유의성 있는 차이가 없었다. 이를 통해, 주목약침이 간 독성에 영향을 미치지 않는다는 점을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과는 KI03에 처치한 주목약침이 formalin으로 유도된 통증 모델의 초기 통증에 대하여 유의성 있는 진통 효과를 가진 것을 의미하며, 간 독성의 가능성이 없을 것으로 예상되어 추후 임상에서 활용도가 높을 것으로 사료된다. 통증의 기전은 여러 가지로 설명되며 formalin 유도 통증의 경우는 앞에서 언급한 early phase와 late phase로 나뉘는데 USV 분석을 통해 얻은 결과를 살펴봤을 때, 주목약침은 early phase에서 말초감작의 1차 구심성 c-fiber의 활성화를 떨어뜨려 진통 효과를 보이나 상대적으로 late phase의 말초 조직에서의 염증성 반응 혹은 중추신경계 감작으로 인한 통증에는 영향력이 적은 것으로 보인다. 반면에, 1차 감작 경로와 관련된 초기 통증 지표 중 하나인 혈장 Substance P 활성도의 분석에서는 열수 추출법으로 얻은 주목약침 처치군만 진통 효과의 유의성을 보였다. 이에 주목약침 중 열수 추출법을 이용한 약침은 초기 통증 혹은 1차 구심로와 관련된 통증에 확실한 진통 효과가 있을 것으로 기대된다. 반면, 에탄올 추출법과 초음파 추출법을 이용한 약침은 USV 분석과 Substance P의 분석 결과가 다소 차이가 있고, 대조군과의 비교가 아닌 약침 처치 군 간 비교에서 효과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다. 이에 주목의 추출 방식에 따라 Substance P 활성에 영향을 주는 약리 성분의 수득 차이가 있다고 사료되며, 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

향후 Substance P 외에 통증과 관련된 성분 및 반응에 대한 실험을 추가하고 실험 개체수를 늘려서 주목약침에 대한 심화 관찰이 필요할 것으로 보인다. 또한, 주목약침의 농도를 조절하거나 다른 약물을 배합하는 실험 등을 통해 진통 정도와 지속력을 높이는 연구가 필요하며, 수득률과 효능을 높일 수 있는 다양한 추출 방식의 개발 및 기존에 밝혀진 항암치료 효과와 더불어 암 환자의 초기 통증 관리와 관련된 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.

KI03에 처치한 주목약침의 진통 효과 및 추출 방식에 따른 효능의 차이를 알아보기 위하여 formalin으로 통증을 유발한 rat의 USV 분석과 혈액 및 혈청학적 변화 등을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

• 1. 주목약침은 formalin으로 유도된 통증 초기에만 유의한 진통효과를 보였다.

• 2. 주목약침이 진통효과를 보였던 통증 초기에서 추출 방식에 따른 효능의 차이는 없었다.

• 3. 주목약침을 열수 추출법으로 얻은 경우에만 혈장 Substance P의 농도를 유의성 있게 감소시켰다.

• 4. AST와 ALT로 알아본 주목약침의 간 독성 여부는 추출 방식에 상관없이 정상군이나 대조군과의 유의성있는 차이가 없었다.

Design an experiment to prove analgesic effects of TCP

NOR: Normal saline(right KI03) + Normal saline(right hind-paw).

CON: Normal saline(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

W: Hot-water extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

E: Ethanol extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

U: Ultrasonification extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

TCP: Taxus cuspidata pharmacopuncture.

AST: Aspartate aminotransferase, ALT: Alanine aminotransferase.

Waveform of USV during the total time of formalin test in each group

USV: Ultrasonic vocalization.

NOR: Normal saline(right KI03) + Normal saline(right hind-paw).

CON: Normal saline(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

W: Hot-water extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

E: Ethanol extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

U: Ultrasonification extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

USV around 18~30 kHz during the early phase and late phase

Data are presented as mean ± S.E.(standard error).

Significant difference between NOR versus CON was evaluated by Student’s t-test.

*: p < 0.05.

**: p < 0.01.

ab means not sharing a common letter are significantly different in CON, W, E and U. Statistically significance was evaluated by One-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at p < 0.05.

USV: Ultrasonic vocalization.

NOR: Normal saline(right KI03) + Normal saline(right hind-paw).

CON: Normal saline(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

W: Hot-water extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

E: Ethanol extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

U: Ultrasonification extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

Effects of TCP on Substance P of formalin-induced pain in rats

Data are presented as mean ± S.E.(standard error).

Significant difference between NOR versus CON was evaluated by Student’s t-test.

*: p < 0.05.

abc means not sharing a common letter are significantly different in CON, W, E and U. Statistically significance was evaluated by One-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at p < 0.05.

TCP: Taxus cuspidata pharmacopuncture.

NOR: Normal saline(right KI03) + Normal saline(right hind-paw).

CON: Normal saline(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

W: Hot-water extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

E: Ethanol extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

U: Ultrasonification extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

Effects of TCP on AST and ALT of formalin-induced pain in rats

Data are presented as mean ± S.E.(standard error).

Significant difference between NOR versus CON was evaluated by Student’s t-test.

Significant differences, except NOR, among four groups were evaluated by One-way ANOVA.

TCP: Taxus cuspidata pharmacopuncture.

AST: Aspartate aminotransferase.

ALT: Alanine aminotransferase.

NOR: Normal saline(right KI03) + Normal saline(right hind-paw).

CON: Normal saline(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

W: Hot-water extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

E: Ethanol extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

U: Ultrasonification extraction of Taxus cuspidata(right KI03) + Formalin(right hind-paw).

Yield of Taxus cuspidata Extracts